氧化应激在肌少症发生过程中作用的研究进展

董欣 王小清 王秀华 莫懿晗

(中南大学 1湘雅护理学院，湖南 长沙 410013；2湘雅二医院老年病科)

肌少症是指与增龄相关的进行性、全身骨骼肌肌量减少和(或)肌力下降或肌肉生理功能减退的一种疾病〔1〕，是一种常见的老年综合征，中国60岁以上社区老年人肌少症的发病率达10.4%〔2〕，而肌少症与活动障碍、跌倒、低骨密度及代谢紊乱等密切相关，是老年人生理功能逐渐减退的重要原因和表现之一，可增加老年人的住院率及医疗花费，严重影响老年人的生活质量，甚至缩短寿命〔3〕。目前国内针对肌少症的研究多集中于危险因素调查，发病机制研究较少，而国外有关机制研究则较为深入，并发现衰老过程中蛋白合成与水解作用失衡、神经-肌肉功能衰退、内分泌功能障碍、慢性炎症和氧化应激损伤等均为肌少症发生的潜在机制〔4〕。其中，大量研究均提出氧化应激可能是肌少症发生的重要机制之一，并与其他发病通路之间存在复杂联系〔5，6〕。本文从氧化还原稳态系统的构成及其在衰老过程中的变化、氧化应激对骨骼肌的影响和维持肌肉氧化应激稳态的运动策略3个方面对氧化应激在肌少症发生过程中的作用进行综述。

1 氧化还原稳态系统与衰老

细胞活动使机体内活性氧(ROS)不断生成，线粒体是其主要的产生场所，最初研究认为，ROS为线粒体氧化磷酸化的副产物，将对机体产生毒害作用，因此机体内也存在多种机制防止ROS产生过多来维持氧化还原稳态，包括防止呼吸链中电子的泄露、清除过多的ROS和氧化损伤分子等，最新研究则指出在生理浓度范围内，ROS是调节机体生长、增殖、分化和适应的重要调节因子〔7〕，但是当机体内自由基的产生和细胞清除自由基的能力不平衡时，将导致机体处于氧化应激状态并对生物分子产生毒害作用。衰老的氧化应激理论认为衰老相关的功能障碍是由于ROS对生物大分子氧化损伤的积累所导致的，并指出衰老过程中常伴随着体内ROS产生的增多和(或)抗氧化防御体系的功能下降〔8〕，但这种变化的原因尚未阐明。其中，ROS产生增多主要与衰老相关的线粒体DNA突变、缺失和损伤引起的线粒体功能障碍有关〔9〕，进一步研究也指出衰老机体清除这些功能障碍线粒体的能力下降〔10〕，不断升高的ROS水平又进一步对线粒体DNA造成损伤，形成恶性循环。关于抗氧化体系功能下降的原因，Zhang等〔11〕指出核因子(NF)-E2相关因子(Nrf)2/亲电子反应元件(EpRE)信号的激活及诱导其抗氧化酶靶基因的表达水平随着年龄增长而下降。但因为每种抗氧化酶基因的调控机制具有极大的复杂性，如血红素加氧酶(HO)-1的表达受Nrf2/EpRE、NF-κB和低氧诱导因子(HIF)-1α等多条信号通路的调控，因此仍需进一步探索Nrf2/EpRE信号通路在衰老相关抗氧化功能下降中的确切机制。研究也发现p53蛋白的亚硝基化是一氧化氮(NO)/过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子(PGC)-1α介导的抗氧化通路中必须经历的一个环节，但在衰老过程中核神经元NO合酶的含量减少，导致p53蛋白的亚硝基化作用显著降低，抗氧化剂生成减少〔12〕，因此，如何维持或恢复p53蛋白的亚硝基化水平也成为维持机体氧化防御系统的一个重要干预靶点。

2 氧化应激对骨骼肌的影响

衰老机体内氧化还原稳态的失衡与很多老年疾病的发生有关，如心血管疾病、阿尔茨海默病、肌少症等〔13〕，其中肌少症是一种多因素致病的老年疾病，其典型表现为骨骼肌肌量减少和(或)肌肉功能下降，研究发现，肌少症患者体内蛋白质羰基、脂质过氧化物、终末糖基化物等氧化修饰产物的浓度均高于正常老年人〔14，15〕，且体内的抗氧化剂如尿酸浓度下降也与老年人肌量减少、肌力下降有关〔16〕，因此衰老过程中氧化还原稳态失衡也被认为可能是肌少症发生的重要机制之一。

2.1肌肉降解作用增强 衰老过程中ROS产生的增加将引起线粒体功能障碍，并激活线粒体介导的细胞凋亡信号通路使肌肉细胞发生凋亡，从而导致肌量减少。高水平的ROS也可直接作为一些凋亡信号通路中的第二信使，促使细胞凋亡〔17〕，研究发现通过给衰老小鼠服用能改善线粒体氧化还原稳态及自噬功能的药物SS31后，虽能维持肌肉内线粒体功能的正常，但不能逆转或缓解肌肉萎缩和肌无力的表现〔18〕，因此，线粒体在ROS介导的肌肉损失中所起到的作用有待进一步研究。肌肉蛋白的水解作用显著超过合成作用被认为是肌少症发生过程中的一个重要环节，研究指出ROS激活p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，并进一步激活叉形头转录因子O亚型(FOXO)3分子，激活的FOXO3分子将抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)合成通路，并激活泛素-蛋白酶体途径中两个关键的肌肉特异性连接酶-肌萎缩盒F蛋白(MAFbx，也称Atrogin-1)和肌肉环指蛋白(MuRF)-1，从而抑制肌肉蛋白的合成同时促进其水解作用，导致肌量减少〔19，20〕。Vina等〔21〕发现在生理状态下，ROS对p38 MAPK的刺激可激活PGC-1α而促进线粒体的生物合成，但当p38 MAPK受到ROS持续性刺激时，这条信号通路将会中断而影响肌肉健康。研究指出衰老小鼠体内mTOR敏感型复合体(mTORC)1的激活将增加信号传导子和转录激活子(STAT)-3的磷酸化使生长分化因子(GDF)15的表达增加并引起肌纤维内出现异常形态的线粒体和氧化应激水平的增加及肌纤维的减少，而抑制mTORC1的激活则可逆转这一过程〔22〕，这也为预防肌少症的发生发展提供了一个可能的干预靶点。

2.2肌肉再生和修复机制受损 肌卫星细胞附着在肌纤维表面，具有干细胞的性质，当肌纤维受损伤时，肌卫星细胞可增殖分化参与肌纤维的修复，对肌肉质量的维持十分重要。Bengal等〔23〕发现衰老进程中，肌卫星细胞的增殖和分化潜能明显降低，虽然确切的分子机制还有待进一步阐明，但氧化应激在其中扮演着重要角色。肌卫星细胞增殖后，部分子细胞会迁移到成体肌纤维中进行分化以维持正常肌量。但老年人体内的肌卫星细胞易发生凋亡诱导的细胞死亡，且衰老肌肉中ROS水平增高，更易触发各种细胞凋亡通路，因此并非所有增殖的肌卫星细胞都能存活下来，同时ROS还能抑制肌卫星细胞分化〔24〕。虽然衰老相关的肌卫星细胞数量减少被认为是肌肉再生和修复的关键限制因素，并与肌少症的发生有关，但也有研究指出即使肌卫星细胞数量减少，剩余驻留的肌卫星细胞也足以激活和维持足够的再生功能，因此衰老肌肉再生能力受损可能与肌卫星细胞的功能变化有关〔25〕。Marzetti等〔26〕发现肌卫星细胞所处的体液环境将会影响肌卫星细胞的功能，而ROS就是其中一个重要的环境影响因子。进一步研究指出肌卫星细胞外在的信号环境和细胞自身一些内在因素的联合调控才是决定肌卫星细胞行为的关键因素，如Sousa-Victor等〔27〕发现老年动物体内的肌卫星细胞表现出细胞周期阻滞而失去了分化和增殖能力，且独立于周围体液环境的变化。因此，ROS如何影响肌卫星细胞的数量和功能并导致肌少症的发生值得进一步探讨。

2.3神经-肌接头(NMJ)功能障碍 骨骼肌的正常收缩依赖于完整的NMJ结构和功能，Ivannikov等〔28〕发现相比于幼鼠，在老年小鼠耳提肌的NMJ处，ROS的产生显著增加，且这种改变似乎与突触释放神经递质减少有关，但是尚不明确发生在NMJ处的增龄相关氧化应激是否会影响肌肉功能。锌铜超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)是机体内一种重要的抗氧化剂，Sod1KO小鼠体内所有组织均缺乏这种酶而表现高水平的氧化应激，同时具有很多衰老进程加快的特征，其中以肌少症症状最为突出，并成为最近几年研究肌少症的一种重要动物模型〔29〕。Jang等〔30〕发现与健康老年小鼠相比，Sod1KO小鼠表现出NMJ退化、乙酰胆碱受体碎片化及运动神经元的退化和回缩，从而导致肌纤维的去神经化，并认为这是Sod1KO小鼠肌肉功能下降的主要原因，随后一系列实验通过基因调控使Cu/Zn SOD表达在不同的组织，探索外周神经氧化还原失衡导致Sod1KO小鼠肌少症发生的机制。Deepa等〔31〕提出肌少症发生的“两次打击”机制，第一次打击是由于外周神经元内氧化还原稳态系统受损，导致NMJ功能障碍，使衰老肌肉内线粒体ROS产生增多；第二次冲击为增多的ROS又进一步导致NMJ发生退化反应使其功能障碍加剧而形成恶性循环，出现肌肉NMJ破裂、去神经支配、肌纤维减少等，并最终可能发展为少肌症。Hamilton等〔32〕也发现衰老过程中高水平的氧化应激将破坏外周运动神经的轴索结构，导致神经传导功能下降而引起肌肉功能障碍。研究指出Sod1KO小鼠外周神经内氧化还原稳态失衡可能与外周神经中过氧化物还原酶6中一个具有催化作用的半胱氨酸残基发生改变有关〔33〕，但外周神经内氧化还原稳态失衡导致NMJ功能障碍的确切机制，仍需要进一步探索。

2.4肌肉兴奋-收缩解耦联 针对衰老过程中氧化应激导致肌力下降的原因，有研究认为与肌肉量和神经肌肉传导无关，而与肌肉内在的收缩结构受损有关。在衰老动物及人体内均发现兴奋-收缩解耦联导致的肌质网钙释放减少与肌力下降相关，钙释放通道(RYR)是兴奋-收缩耦联中的一个重要结构，Thomas等〔34〕发现衰老过程中RYR的表达没有减少，但RYR具有较长的半衰期使其容易受到翻译后修饰。进一步研究指出在衰老小鼠与人体内RYR中钙通道稳定蛋白(calstabin)的氧化程度升高，这种蛋白与每个RYR单位结合，起到稳定通道的作用，calstabin蛋白的氧化修饰使其与RYR的相互作用受损，导致钙释放通道出现漏钙现象，肌浆网内的钙量减少，进一步使其释放量减少，最终可导致肌力下降〔35〕。Lamboley等〔36〕则发现抗氧化剂二硫苏糖醇治疗可逆转老年人体内肌质网钙泄露，促进肌力恢复，但仍需要进一步探讨RYR的氧化修饰达到什么程度才会引起肌少症的发生。和RYR一样，肌浆网/内质网钙三磷酶腺苷酶(SERCA)同样也具有较长的半衰期，使其容易受到氧化损伤，Qaisar 等〔37〕发现Sod1KO小鼠SERCA的氧化修饰蛋白增加。对此，最近一项研究发现与没有治疗的Sod1KO小鼠相比，采用一种新型的SERCA激活剂CDN1163对Sod1KO小鼠进行6 w治疗后，可缓解23%的肌量减少和22%的肌力下降，此外还能逆转线粒体ROS产生的增加〔38〕，提示维持SERCA功能的药物具有预防氧化应激介导的肌肉功能障碍的潜能。

3 维持肌肉氧化应激稳态的运动策略

相对于静止肌肉，收缩肌肉内ROS的产生将显著增加，同时有研究指出，耐力运动将促进肌肉的氧化、代谢和热应激，并将激活一些与肌肉适应相关的细胞通路，一方面促进了线粒体的生物合成，另一方面通过两条相互独立的通路来改善线粒体质量，一是改变线粒体动力学，二是促进线粒体的自噬作用〔39，40〕，Bouzid等〔41〕也发现终身的规律运动可促进抗氧化酶表达，而服用抗氧化复合制剂治疗后将抵消运动带来的有益的肌肉适应效应，表明ROS在运动过程中扮演这一个重要的信号分子作用，机体内一些维持肌肉稳态的细胞成分如NF-κB、活化蛋白(AP)-1、MAPKs等对氧化还原环境的改变非常敏感〔42〕，而适度运动可促进MAPKs的激活，并进一步激活NF-κB，从而诱导抗氧化酶的表达〔43〕。但目前关于预防或治疗肌少症的最佳运动类型、强度、频率等尚无定论，尤其是运动强度。一些研究认为低中等强度运动对维持肌肉功能无益，但高强度运动又导致一些细胞成分出现氧化应激损伤〔44，45〕，如Lee等〔46〕发现长时间剧烈训练使老年人体内线粒体的融合蛋白(Mfn2)和分裂蛋白(Drp1)数量减少，使线粒体功能发生障碍。目前，维持肌肉氧化还原平衡的运动类型主要包括耐力运动、抗阻运动、抗阻联合耐力运动、平衡运动等〔47〕，此外，对一些无法正常进行运动锻炼的老年人，肌肉电刺激成为一种具有应用前景的运动替代方法，能产生与耐力运动相似的分子调控效应，同时还可激活蛋白质的合成代谢通路，促进肌肉蛋白合成等〔48〕，但仍需进一步的研究来探讨肌电刺激对改善肌少症患者肌肉质量和功能的最佳电流(或电压)、时间、频率等参数。

综上，在衰老过程当中，各种因素导致机体内氧化还原稳态系统失衡使机体处于氧化应激状态，过多的ROS通过调控各种信号通路，一方面破坏了肌肉内蛋白质稳态，并可能损害肌卫星细胞的功能使得肌肉量减少；另一方面也可能直接造成神经-肌接头和兴奋-收缩耦联等结构出现功能障碍而出现肌肉功能下降，并最终导致肌少症的发生，虽然目前尚不明确这些机制之间的联系，但为预防或治疗肌少症提供了重要的靶点，未来的研究可从以下方面进行：(1)进一步分析衰老过程中抗氧化防御体系减弱(如抗氧化酶表达减少或活性降低)的分子机制；(2)进一步验证线粒体在ROS介导的肌肉损失中所起到的作用，探索能够阻断ROS对IGF-1/PI3K/Akt/mTOR蛋白合成通路产生抑制作用的干预方法；(3)进一步探讨ROS对肌卫星细胞的数量和功能影响的确切机制；(4)分析外周神经内氧化还原稳态失衡导致NMJ功能障碍的分子机制；(5)制定一套能有效维持肌肉内氧化还原稳态的运动处方，并且针对一些无法进行体力活动的老年人群，探索如何利用物理治疗手段(如肌肉电刺激)来作为运动的替代疗法，从而预防或缓解肌少症的发生发展。