壮通饮对缺氧/复氧诱导的HUVEC/U251细胞屏障损伤的影响*

李 岩， 王凯华△， 朱 亮， 赖思嘉， 李曼菲， 何 青，麻小梅， 梁慧荟， 杨鑫勇， 王亚南

（1广西中医药大学附属国际壮医医院脑病科，广西 南宁 530201；2广西中医药大学，广西 南宁 530200）

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是由脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞以及基膜组成的血液与脑组织之间的屏障，在维持中枢神经系统的稳态方面发挥至关重要的作用［1］。已有研究证明，脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病和脑外伤等神经系统疾病患者的BBB 通透性会增加，导致脑组织炎症细胞浸润、脑水肿而进一步加重脑损伤［2］。许多中药通过改善血脑屏障通透性参与治疗脑神经相关性疾病［3］。 壮医经验方壮通饮（Zhuangtongyin，ZTY）由扶芳藤、参三七和黄花倒水莲3 味广西特色壮药配伍而成，具有抗血栓、抗凝血、抗炎及抗氧化等作用，有广泛临床用药基础，也常作为治疗脑梗死的经验药方［4］。前期研究发现ZTY 与西药联合使用降低了缺血性脑中风患者神经受损程度、提高生活自理能力，并无明显副反应［5］，但机制尚不清楚。因此，本实验观察ZTY 对人脐静脉血管内皮细胞（hu‑man umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和人星形细胞瘤U251 细胞共培养模型中紧密连接蛋白［tight junction proteins，TJPs；包括密封蛋白（clau‑dins）、闭合蛋白（occludin）、连接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）和闭锁小带蛋白1（zonula occuldens-1，ZO-1）］、基质金属蛋白酶（matrix metal‑loproteinases，MMPs）和内皮素1（endothelin-1，ET-1）的影响，研究ZTY 对缺氧/复氧诱导的BBB 损伤的作用及机制。

材料和方法

1 实验动物

8只8周龄雄性SD大鼠（体重250～300 g）来源于三峡大学，于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）条件下饲养。饲养环境为温度22～26 ℃，相对湿度50%～60%，人工光照明暗各12 h。实验动物使用许可证号为SYXK（鄂）2018-0104，实验动物在武汉华联科生物技术有限公司屏障环境动物实验设施（No.00285918）饲养和实验，合格证号为No.42010200004170。所有动物实验均符合湖北省动物管理委员会《实验动物伦理证》的相关规定。

2 细胞与试剂

HUVEC来源于iCell；U251细胞来源中国科学院上海细胞库。戊巴比妥钠购自Sigma；ZTY 药材来自广西国际壮医医院民族药房；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco；PBS、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、过硫酸铵、RIPA（强）组织细胞快速裂解液和BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自Solarbio；低糖DMEM 购自HyClone；PVDF 转移膜和化学发光试剂均购自Millipore；蛋白Marker 购自Helix；兔抗clau‑din 3 抗体、兔抗JAM 抗体、兔抗occludin 抗体、兔抗ZO-1 抗体、兔抗ET-1 抗体和羊抗兔IgG 均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 ZTY 的制备［6］将扶芳藤30 g、黄花倒水莲25 g 和参三七10 g 去除杂质切制，加入生药材10 倍量的水浸泡60 min 后，用TC-15 套式恒温器250 V 电压加热煎煮，沸腾后将电压调低至150 V，微沸状态下煎煮1 h 后滤取煎液。药渣再加入生药材8 倍量的水，同法煎煮1 h 后滤取煎液。两次煎液混合后，于恒温水浴锅（100 ℃）蒸发去水分至浓稠状，转入恒温烘箱（60 ℃）干燥，获干浸膏，称重，收膏率为36.80%，4 ℃保存备用。临用前使用蒸馏水溶解浸膏至生药材含量为200 g/L。

3.2 ZTY 含药血清的制备将8 只SD 品系大鼠适应性喂养7 d 后，分为4 组：空白组及低、中、高剂量ZTY 组，每组2 只。空白组大鼠等体积蒸馏水灌胃。低、中、高剂量ZTY 组分别采用浓度为0.374 g/mL、0.748 g/mL 和1.496 g/mL 的ZTY 灌胃，10 mL/kg，连续7 d。最后一次灌胃2 h 后，用3% 戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，提取各组血清，于−70 ℃冻存。若发现动物未死亡，使用100 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉至无心跳无呼吸后确定动物死亡。

3.3 细胞复苏及培养将冻存的细胞从液氮罐中取出后，37 ℃水浴融化后加入4 mL 完全培养基，500 r/min 离心3 min，弃上清，加入完全培养基，37 ℃、5% CO2的培养箱内培养。HUVEC 完全培养基为原代内皮细胞基础培养基+原代内皮细胞培养添加剂+5% FBS 和1% 双抗；U251细胞完全培养基为DMEM+10% FBS，细胞均按照1∶2～1∶3进行传代。

3.4 体外HUVEC/U251 细胞缺氧/复氧模型的建立［7-9］采用Transwell 系统共培养方法（图1），将2 mL U251 细胞接种到Transwell 小室的下室，37 ℃下培养24 h，待细胞达到60% 融合后，在Transwell 小室内侧接种HUVEC，于37 ℃培养24 h，直到显微镜观察2 种细胞达到高密度共培养。此时用跨内皮细胞电阻（transendothelial electric resistance，TEER）检测共培养细胞模型通透性的变化。TEER≥120 Ω 后把其中的培养基改为低糖DMEM 培养基，并在不含有氧气的培养环境（95% N2、5% CO2）中培养2 h后换成完全培养基于37 ℃、5% CO2培养箱内进行复氧培养2 h。

Figure 1.Co-culture of HUVEC and U251 cells with Transwell system.图1 Transwell系统共培养HUVEC和U251细胞

3.5 细胞分组各组细胞中添加不同的血清培养基37 ℃、5% CO2培养24 h。实验分组如下：（1）空白（control）组：共培养细胞模型+含10% 空白血清培养基；（2）模型（model）组：缺氧/复氧共培养细胞模型+含10% 空白血清培养基；（3）低剂量ZTY 组：缺氧/复氧共培养细胞模型+含10%低剂量ZTY血清培养基；（4）中剂量ZTY 组：缺氧/复氧共培养细胞模型+含10% 中剂量ZTY 血清培养基；（5）高剂量ZTY 组：缺氧/复氧共培养细胞模型+含10% 高剂量ZTY 血清培养基。

3.6 TEER 的检测［10］将电阻仪及筷子电极紫外灯消毒30 min，连接筷子电极至电阻仪，打开电阻仪开关，静置筷子电极，待筷子电极电阻值稳定后，弃去上下室培养基，用D-Hanks 溶液分别冲洗上下小室后，加入适量的D-Hanks 溶液使上下室液面持平。稳定后将筷子电极垂直插入Transwell 小室中，长的一侧电极插入下室，短的一侧电极插入上室，电极膜片置于液面下，不触碰小室，分别测量各孔不同位置的电阻值，重复3次，并记录显示屏上的电阻值（Ω），取平均值记为每孔的测量值。根据公式计算出实际电阻值：实际电阻值（Ω·cm2）=（实验孔测量值−空白孔测量值）×PET膜面积（cm2）。

3.7 Western blot 实验收集HUVEC，用预冷的1×PBS 洗涤细胞后，将细胞密度稀释为1×106/L，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液200 μL，充分裂解后，取上清进行蛋白质定量。SDS-PAGE 分离后，90 V转膜50 min，5% 脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加Ⅰ抗（1∶1 000）室温孵育1 h，洗膜，加Ⅱ抗（1∶10 000），室温孵育1 h，洗膜。选用ECL 化学发光法显色，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

3.8 RT-qPCR 检测mRNA 表达收集HUVEC，用Trizol 法提取各组细胞总RNA，将mRNA 反转录成cDNA。以逆转录后cDNA 为模板进行qPCR 扩增。PCR 条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40 个循环。β-actin 作为内参照进行样品间的校正，使用2−ΔΔCt法进行统计分析。引物序列见表1。

4 统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，实验数据均以均数±标准差（mean±SD）表示，单因素方差分析比较多组间差异，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 HUVEC/U251细胞的形态学观察

培养24 h 后，HUVEC 生长情况良好，呈卵圆形、多角形或梭形；U251 细胞密集生长，外形不规则，有较多突起，形成分支将彼此连接，见图2。

2 ZTY 减轻体外共培养HUVEC/U251 细胞屏障的损伤

Figure 2.The morphological observation of HUVEC and U251 cells（×200）.图2 HUVEC和U251细胞的形态学观察

检测不同组共培养HUVEC/U251 细胞的TEER，结果见图3。与空白组相比，模型组细胞的TEER 显著降低［（177.78±10.64）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2］，表明模型组细胞的致密性及完整性遭到破坏，通透性增加，共培养HUVEC/U251 细胞屏障损伤模型建立成功；与模型组相比，细胞血清中添加不同剂量的ZTY 共培养后，其TEER 呈现上升趋势，低、中、高剂量ZTY组TEER与模型组相比差异均有统计学意义［（92.92±1.75）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2；（115.15±9.09）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2；（127.27±3.03）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2］。

Figure 3.Effect of ZTY at different doses on transendothelial electric resistance （TEER） of co-cultured HUVEC/U251 cell barrier in vitro.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P <0.05 vs model group.图3 不同剂量ZTY 对体外共培养HUVEC/U251 细胞屏障跨内皮细胞电阻的影响

3 ZTY 能够降低共培养HUVEC 中MMPs 及ET-1的mRNA水平

通过RT-qPCR 检测各组HUVEC 中MMPs 及ET-1 的mRNA 表达情况，结果如图4 所示。与空白组相比，模型组MMP2、MMP3、MMP9 和ET-1 的mRNA 表达水平均显著升高；细胞血清中添加不同剂量的ZTY 共培养后，MMP2、MMP3、MMP9 和ET-1 的mRNA 表达均呈剂量依赖性下降趋势。与模型组相比，低剂量ZTY 组HUVEC 中MMP2 和ET-1 的mRNA表达差异无统计学显著性（P>0.05），但MMP3 和MMP9 的mRNA 表达水平均显著降低（P<0.05），而中、高剂量ZTY 组HUVEC 中MMP2、MMP3、MMP9和ET-1的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）。

4 ZTY 对共培养HUVEC 中claudin 3、JAM、occludin、ZO-1和ET-1蛋白水平的影响

与空白组相比，模型组HUVEC 中claudin 3、JAM、occludin和ZO-1蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05），ET-1 蛋白的相对表达量显著升高（P<0.05）；与模型组相比，中、高剂量ZTY 组HUVEC 中claudin 3、JAM、occludin 和ZO-1 蛋白的相对表达量显著升高（P<0.05），ET-1 蛋白的相对表达量显著降低（P<0.05），见图5和表2。

表2 Western blot检测claudin 3、JAM、occludin、ZO-1和ET-1的蛋白表达水平Table 2.The protein expression levels of claudin 3，JAM，occludin，ZO-1 and ET-1（Mean±SD. n=3）

讨 论

研究发现，脑缺血再灌注损伤导致微血管结构改变、BBB 结构及功能受损、脑内微环境失衡、脑水肿及缺血性脑损伤再发展［11-13］。由于BBB 结构较复杂，对其通透性的研究通常是通过建立体外共培养细胞模型而开展的，脑血管内皮细胞和星形胶质细胞的共培养模型应用较广泛［14］。本研究利用Tran‑swell系统共培养HUVEC 和U251细胞建立体外细胞屏障的缺氧/复氧模型，模拟体内BBB 损伤。与空白组相比，模型组细胞TEER 明显降低，表明模型建立成功。

Figure 4.Effect of ZTY on the mRNA expression of MMPs and ET-1 in co-cultured HUVEC.A：relative mRNA expression of MMP2；B：relative mRNA expression of MMP3；C：relative mRNA expression of MMP9；D：relative mRNA expression of ET-1.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs model group.图4 ZTY对共培养HUVEC中MMPs及ET-1 mRNA表达水平的影响

Figure 5.The representitive images of Western blot for deter‑mining the protein expression levels of claudin 3，JAM，occludin，ZO-1 and ET-1.图5 Western blot 检测claudin 3、JAM、occludin、ZO-1 和ET-1蛋白表达水平

TJPs是组成血脑屏障的结构及基础，由claudin、occludin 和JAM 三种跨膜蛋白及包浆附着蛋白（ZO-1、ZO-2 和ZO-3）等组成，以二聚体形式存在的跨膜蛋白与同型蛋白结合形成封闭链，将细胞间隙封闭起来，而附着蛋白则是跨膜蛋白和细胞骨架之间的连接蛋白，TJPs 的丢失是BBB 功能破坏的一个指标［15］。Li 等［16］构建了缺氧/复氧诱导的BBB 损伤模型，其结果显示，缺氧/复氧模型组TJPs（ZO-1和clau‑din-5）的表达显著减少，提示屏障完整性被破坏。MMPs 是多功能内肽酶，在大脑中对组织形成、神经元网络重塑和BBB 完整性至关重要［17］。在神经系统疾病中，MMPs可以分解基底膜的细胞外基质蛋白并降解TJPs，导致BBB 破坏［18］。王圆圆等［19］在研究瑞舒伐他汀对缺氧/复氧引起的脑微血管内皮细胞损伤的作用时，发现缺氧/复氧引起的脑微血管内皮细胞中MMPs（MMP-9 和MMP-2）表达均显著增加。本研究与上述研究结果类似，相比于空白组，体外细胞屏障缺氧/复氧模型组细胞中的TJPs 表达下调，MMPs 表达上调，表明缺氧/复氧可显著影响TJPs 和MMPs，导致BBB 通透性和功能发生改变。这再次证实TJPs 和MMPs 与细胞屏障功能紧密相关，模型组细胞屏障受损。

ET-1 是由21 个氨基酸组成的缩血管活性多肽，调节心血管收缩的重要因子［20］。ET-1可引发脑缺血性损伤［21］，并且高浓度ET-1 与急性缺血性卒中的不良预后和高死亡率也密切相关［22］。ET-1在脑损伤中作用的研究较多。Armstead 等［23］的研究表明，脑卒中后ET-1 和c-Jun 氨基末端激酶表达上调促使白细胞介素6 大量释放，破坏脑血管自动调节功能，加剧组织病理进展。Ronaldson 等［24］发现，ET-1 与G 蛋白偶联受体ETB结合，使酪氨酸激酶磷酸化，激活PI3K/Akt 及p42/p44 MAPK 通路，促使诱导型一氧化氮合成酶表达并合成NO，进一步硝化酪氨酸而激活MMP9，促使BBB 结构受损并加剧脑水肿。ETA/ETB非选择性拮抗剂能缓解创伤性脑损伤小鼠的BBB 破坏和脑水肿［25-26］。这均表明ET-1 可作为脑缺血损伤的标志物。我们的实验发现，缺氧/复氧损伤后ET-1蛋白表达显著升高，给予中、高剂量ZTY 治疗后，模型组BBB通透性降低，表现为细胞中TJPs表达上调，MMPs 表达下调；此外，中、高剂量ZTY 可降低ET-1蛋白表达。低剂量ZTY 未改变缺氧/复氧后BBB 细胞通透性，但细胞中ET-1、MMP3 及MMP9 的表达降低。本研究结果表明，缺氧/复氧损伤发生后，TJPs表达下调，MMPs 表达上调，提示细胞屏障通透性增加；同时ET-1 表达上调；而ZTY 可上调TJPs、下调MMPs 并降低ET-1 蛋白水平，说明ZTY 通过调节TJPs、MMPs 和ET-1 表达，改善细胞屏障的通透性，减轻缺氧/复氧引起的细胞屏障损伤。

本研究初步确定ZTY 可通过抑制ET1 和MMPs表达、上调TJPs 表达而减轻缺氧/复氧体外共培养细胞屏障的损伤，但MMPs 和TJPs 的排列方式与细胞屏障功能的作用机制尚有待进一步研究。