基于WGCNA 和分子对接分析干姜黄芩黄连人参汤干预胃腺癌的成分及靶点

孙 倩 杨美子 栾继昕 李 森 张 帆

1.山东省聊城市人民医院临床药学科，山东聊城 252000；2.滨州医学院药理学教研室，山东烟台 264003；3.山东第一医科大学研究生院，山东泰安 271000；4.山东省聊城市人民医院内分泌科，山东聊城 252000

胃腺癌是胃癌最常见的病理分型，其复发转移率高[1-2]。目前中医药在预防胃腺癌复发转移方面受到越来越广泛的关注[3]。干姜黄芩黄连人参汤中的药物包括干姜、人参、黄连和黄芩，研究表明，这四种成分具有较强的抗肿瘤功效[4-7]，但该药物抗胃腺癌的机制仍未明确。加权基因共表达网络分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）可以探索基因网络与疾病性状的关系[8]。本研究通过网络药理学的方法筛选出药物中的活性成分，利用WGCNA 和网络拓扑学分析筛选与胃腺癌风险等级相关的关键靶点，运用分子对接技术进行半柔性对接，反向验证药材化合物与关键靶点之间的相互作用，以探究药物抗胃腺癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 筛选药物活性成分

采用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），检索获得已知化学成分，筛选标准为类药性（drug likeness，DL）≥0.18 并且口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，利用TCMSP 数据库收集已知药物化学成分的预测靶点。

1.2 药物作用靶点预测

检索GenCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库得到与胃腺癌相关的作用靶点，将药物预测靶点与胃腺癌相关靶点相互交集，构建药物-化合物-靶标相互作用网络。

1.3 基因表达数据处理

胃腺癌的基因表达数据和临床数据在TCGA 中下载得到。利用R 语言筛选差异表达基因，设置标准为|log2FC|＞1、P ＜0.05，得到差异基因的火山图和热图。

1.4 WGCNA

采用R 语言构建权重基因共表达网络，通过皮尔森相关系数筛选共表达模块。将共同靶点最多的模块作为药物干预胃腺癌的目标模块。

1.5 GO 及KEGG 富集分析

根据GO 及KEGG 富集分析对WGCNA 得到的共有靶点进行富集分析，设定P ＜0.05，筛选出药物具有显著性差异的GO 功能和KEGG 通路信息，并绘制气泡图。

1.6 核心靶点的筛选

将WGCNA 得到的共同靶点上传至STRING，建立药物靶蛋白-胃腺癌靶蛋白相互作用网络。利用CytoNCA 插件筛选关键基因，将其作为关键靶点。

1.7 成分-靶点分子对接

关键靶点的2D 结构文件从RSCB PDB 数据库下载得到，运用Pymol 软件移除潜在生物标志物中的配体和非蛋白分子。关键化合物2D 结构文件从PubChem 数据库下载得到，最后运用AutoDock 软件进行半柔性对接。

2 结果

2.1 药物活性成分

通过TCMSP 数据库，筛选出活性化合物共59 个，其中5 个来自干姜，29 个来自黄芩，11 个来自黄连，14 个来自人参。这59 个化合物包括：黄芩新素（neobaicalein）、黄麻甙A（corchoroside A）等，主要活性成分见表1（根据OB 值仅列出前5 项）。在TCMSP数据库输入这59 个化学成分，经过筛选共得到184 个药物潜在活性靶点。

表1 干姜黄芩黄连人参汤部分活性成分基本信息

2.2 药物治疗胃腺癌作用靶点预测

在GenCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 数据库共收集到胃腺癌作用靶点8758、170、314、37、41 个，剔除重复靶点后共收集8953 个靶点（图1A）。将药物和胃腺癌潜在靶点取交集后共得到163 个靶点，即药物治疗胃腺癌潜在作用靶点（图1B）。

图1 数据库及药物和疾病共有靶点的维恩图

2.3 药物-化合物-靶点相互作用网络

药物-化合物-靶点相互作用网络总共包括242 个节点和673 条边，如图2 所示，其中紫色、绿色、红色、蓝色圆形分别代表黄芩、人参、干姜、黄连所属化合物，黄色代表靶标基因。排名前5 位的化合物分别是槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、千层纸素A。

图2 药材-化合物-靶点相互作用网络

2.4 胃腺癌的差异表达基因

最终筛选得到32 例癌旁和375 例癌症的基因表达谱数据，表达差异的基因共计6739 个，其中有3915 个上调，2824 个下调。见图3。

图3 差异基因的热图和火山图

2.5 基因模块选择和作用靶点确定

选择临床特征进行WGCNA 相关性分析。绘制差异表达基因聚类树状图（图4A），计算模块与临床数据的相关性，绘制热图（图4B）。将模块中所包含的靶点分别与化合物作用靶点比对，结果显示蓝色模块中包含32 个共同靶点，与肿瘤等级呈正相关。

图4 聚类树状图和相关性热图

2.6 GO 和KEGG 富集分析

分子层面涉及的GO 富集分析有DNA 完整性检验点、对金属离子的反应等（图5A）。KEGG 通路排名靠前的主要涉及p53 信号通路、细胞周期和细胞衰老等（图5B）。

图5 GO 和KEGG 富集分析气泡图

2.7 潜在生物标志物筛选

首先得到一个具有113 条边、30 个节点的网络，进一步筛选后得到一个具有25 条边、8 个节点的网络，3 次最终筛选得到3 个关键基因作为潜在生物标志物，分别为VEGFA、CDK1、CCND1，过程见图6。

图6 治疗胃腺癌关键靶点的筛选策略图

2.8 分子对接结果

将关键靶点与关键化合物进行分子对接，结果见表2。核心化合物与关键靶点结合能均≤-30 kJ/mol，结构较为稳定。见表2、图7。

图7 核心化合物与关键靶点的分子对接结果

表2 关键靶点与化合物的对接结果

3 讨论

本研究通过WGCNA 联合网络药理学及分子对接方法，在分子层面揭示了干姜黄芩黄连人参汤抗胃癌的活性成分、作用靶点和信号通路，初步阐释了其抗胃腺癌的作用机制可能是通过药物核心化学成分调节VEGFA、CDK1、CCND1 三个关键靶点，影响p53信号通路等过程起到抗癌作用。

干姜黄芩黄连人参汤出自《伤寒论》，四种药材寒温并用，缺一不可，有散结除痞之功[9]。本研究通过网络药理学分析得到核心化合物主要包括汉黄芩素、黄芩素、槲皮素等，这些化合物同属于黄酮类化合物，不会产生拮抗作用。汉黄芩素、黄芩素可通过抗肿瘤血管发生抑制癌细胞的增殖[10]，槲皮素可促进癌细胞凋亡[11]。山柰酚具有广谱抗肿瘤活性，对胃癌细胞具有抑制作用[12-13]。通过KEGG 富集分析得到药物核心化学成分可通过p53 信号通路、细胞周期等发挥抗癌作用。槲皮素可通过上调p53 来增强曲古抑菌素A的抗肿瘤活性[14]，同时汉黄芩素能够抑制人胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞衰老，加速其凋亡[15]。分子对接结果显示，核心化合物与关键靶点结合活性较高，提示这些化合物可通过调节关键靶点发挥抗癌作用。

VEGFA 是一种促血管生长因子，其促血管生成作用最强、专属性也最高[16]。VEGFR 可以与VEGFA特异结合来介导血管的生成[17]。研究表明胃腺癌患者的肿瘤分期和预后与胃腺癌组织中VEGFA 的异常表达密切相关[18-20]。CDK1 是一种周期蛋白依赖性蛋白激酶，由催化激酶亚基和细胞周期蛋白蛋白伴侣组成，具有调控细胞周期的重要功能[21]。CDK1 在大多数恶性肿瘤中的表达均增加，其中就包括胃腺癌。CDK1作为抗肿瘤药物研发的有效靶点，可显著抑制肿瘤的生长[22-23]。CCND1 是细胞周期蛋白家族中最重要的细胞周期正调节器[24]。CCND1 可以调整细胞周期不同阶段的进展，在细胞周期中发挥特定作用。CCND1 基因多态性与多种消化系统肿瘤密切相关[25-26]。

综上所述，本研究应用网络药理学、WGCNA、分子对接技术对干姜黄芩黄连人参汤中的活性化合物与作用靶点进行了分析，初步得到其抗胃腺癌的作用机制是通过核心化学成分调关键靶点，影响p53 信号通路、细胞周期和细胞衰老等过程起到抗癌作用。本研究结果为后续研究提供了理论基础和重要依据，为今后研发新药指明了方向。