不同频率电针对脑缺血再灌注模型大鼠的影响

廖 恒 范荣国 李又春 高玉姣 穆敬平

1.湖北省十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院睡眠心身医学中心，湖北十堰 442000；2.湖北省丹江口市第一医院健康管理科，湖北丹江口 442700

大脑是学习记忆最基本、最重要、最高级的神经单元[1]。脑血流中断后再灌流是导致脑缺血再灌注的根本原因[2]。脑缺血再灌注发生率和致死率高，属脑卒中最严重的续发性损伤[3-4]。解决微循环障碍、改善或维持血脑屏障的完整性是减轻神经功能损伤的关键[5-7]。电针刺激百会、神庭、水沟具有脑保护作用[8]。但不同频率电针的作用却不尽相同，本研究观察不同频率电针对大脑中动脉闭塞大鼠脑缺血再灌注模型的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠50 只，SPF 级，56 日龄，体重（235±5）g，购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司[许可证号：SYXK（鄂）2016-0031，合格证号：SCXK（鄂）2016-0008]，伦理审批：湖北医药学院动（福）第2017-59；实验符合3R 原则，满足动物福利。

1.2 主要设备与试剂

LH202H 型韩氏穴位神经刺激仪（北京华运安特科技有限公司）；Morris 水迷宫（成都泰盟软件有限公司）；FBR-1 型电解式组织血流计（日本生物医药公司）；KES900D 全自动血流变检测仪（无锡康尔生电子科技有限公司）；伊文思蓝（上海懋康生物科技有限公司）；SpectraMax Paradigm 多功能酶标仪由美谷分子仪器（上海）有限公司提供。

1.3 研究方法

1.3.1 造模与分组 随机选取10 只大鼠作为假手术组，其余采用大脑中动脉闭塞法建立脑缺血再灌注模型，造模成功后采用随机数字表法将其分为模型组和高、中、低频电针组，每组10 只。建模参考文献[9]：麻醉后依次分离颈外动脉-颈内动脉-颈内动脉的颅外分支-翼腭动脉。夹闭颈内动脉、颈总动脉远心端，于颈外动脉远心端剪口插栓线，松开动脉夹并缓慢推进至出现明显的阻力感即可，阻断供血1 h 后复灌1 h即成模，以改良Zea Longa 神经功能缺损评分1～7 分为成模标准[10]。假手术组手术同前但不插栓线。

1.3.2 干预措施 取穴参考《实验动物常用穴位名称与定位》[11]。于术后第2 天，高（100 Hz）、中（50 Hz）、低（2 Hz）频电针组均取百会、神庭、水沟穴。用0.25 mm×1 mm 针灸针提插捻转后接LH202H 型刺激仪。选疏密波，电流：2 mA。25 min/次，1 次/d，连续干预5 d 后间隔2 d，共干预4 周，假手术组和模型组不予干预。

1.3.3 糖水偏好实验 将两个200 ml 的水瓶同时放于笼中。第1 天两瓶均装蔗糖水（1%），第2 天将其中一瓶换装纯水，自由饮1 h 后取走并计算糖水偏爱率[糖水消耗量/（糖水+纯水）×100%][12]。

1.3.4 Morris 水迷宫实验 定位航行记录逃避潜伏期。如动物1 min 内未找到则引导到平台并停留20 s。训练1 次/d，共7 d，然后撤掉平台并记录60 s 内穿台次数[13-14]。

1.3.5 局部脑血流量（regional cerebral blood flow，rCBF）在动物右侧颅顶皮下安置记录电极，于造模后和干预1～4 周时测量其rCBF[15]。

1.3.6 血脑屏障通透性 股静脉注射2%伊文思蓝（4 ml/kg），2 h 后断头处死，取全脑，置于甲酰胺溶液中浸泡10 min，研磨匀浆，60℃孵育24 h 后离心，离心半径为7 cm，4000 r/min 离心15 min，取上清。酶标仪调至520 nm，测量光密度值，绘制标准曲线，得出伊文思蓝浓度[16]。

1.3.7 血液流变学指标及红细胞渗透脆性（osmotic fragility of erythrocyte，EOF）经股动脉取全血2 ml 测定血液黏滞度（高、中、低切）、血浆黏度、红细胞聚集指数。取14 支干燥肝素管分别加入2.0 ml不同浓度NaCl 溶液，每支试管内加入新鲜血液0.1 ml。开始出现溶血现象的NaCl 溶液浓度为最小EOF，出现完全溶血现象时的NaCl 溶液浓度为最大EOF。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；各时间点间rCBF 的比较采用重复测量方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组糖水偏好实验及Morris 水迷宫试验结果比较

模型组糖水偏爱率低于假手术组，逃避潜伏期长于假手术组，穿台次数少于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。高、中、低频电针组糖水偏爱率高于模型组，逃避潜伏期均短于模型组，穿台次数多于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。低频电针组糖水偏爱率高于高、中频电针组，逃避潜伏期短于高、中频电针组，穿台次数多于高、中频电针组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。高、中频电针组各指标比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 五组糖水偏好实验及Morris 水迷宫试验结果比较（）

表1 五组糖水偏好实验及Morris 水迷宫试验结果比较（）

注 与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与高频电针组比较，cP ＜0.05；与中频电针组比较，dP ＜0.05

2.2 五组各时间点rCBF 比较

假手术组各时间点rCBF 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。模型组及高、中、低频电针组组内各时间点rCBF 比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。模型组各时间点的rCBF 均低于同期假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。高、中、低频电针组造模后rCBF与模型组比较，三组造模后rCBF 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。高、中、低频电针组干预1～4 周的rCBF 均高于同期模型组，低频电针组干预1～4 周的rCBF 均高于同期高、中频电针组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。高、中频电针组各时间点的组间比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 五组各时间点rCBF 结果比较（%，）

表2 五组各时间点rCBF 结果比较（%，）

注 与本组造模后比较，aP ＜0.05；与本组干预1 周比较，bP ＜0.05；与本组干预2 周比较，cP ＜0.05；与本组干预3 周比较，dP ＜0.05；与同期假手术组比较，eP ＜0.05；与同期模型组比较，fP ＜0.05；与同期高频电针组比较，gP ＜0.05；与同期中频电针组比较，hP ＜0.05。rCBF：局部脑血流量

2.3 五组血液流变学指标及EOF 比较

模型组血液黏滞度高、中、低切及血浆黏度、红细胞聚集指数高于假手术组，最大、最小EOF 低于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。高、中、低频电针组血液黏滞度高、中、低切及血浆黏度、红细胞聚集指数均低于模型组，最大、最小EOF 高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。低频电针组血液黏滞度高、中、低切及血浆黏度、红细胞聚集指数均低于高、中频电针组，最大、最小EOF 高于高、中频电针组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。高、中频电针组各指标比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表3 五组血液流变学指标及EOF 比较（）

表3 五组血液流变学指标及EOF 比较（）

注 与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与高频电针组比较，cP ＜0.05；与中频电针组比较，dP ＜0.05。EOF：红细胞渗透脆性

2.4 五组血脑屏障通透性指标比较

模型组脑组织伊文思蓝含量为（57.19±2.37）μg/g，高于假手术组（14.91±1.39）μg/g，差异有统计学意义（t=48.662，P ＜0.05）。高、中、低频电针组伊文思蓝含量分别为（20.81±1.73）、（32.08±3.17）、（31.54±2.35）μg/g，均低于模型组，且低频电针组低于高、中频电针组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。高、中频电针组伊文思蓝含量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

3 讨论

脑缺血再灌注占脑卒中的56.6%，常造成神经元严重损伤[17]。作为我国传统医学瑰宝，针刺或电针对脑卒中后神经功能的恢复作用显著。研究表明，针刺百会、神庭、水沟可改善脑卒中认知功能障碍及上肢痉挛[18-19]，而电针则可显著改善认知功能[20]，减少脑出血量，提高rCBF，显著促进卒中大鼠神经功能恢复[21]。低频电针组逃避潜伏期低于高、中频电针组，穿台次数多于高、中频电针组，提示低频电针在促进脑缺血再灌注模型大鼠提高学习记忆力方面较高频、中电针优势更明显。低频电针对于缓解痉挛、增加缺血区血流量、改善脑卒中肢体运动功能有积极作用[22]。低频电针可输出微量低频脉冲电流刺激受损脑组织使其“觉醒”，能更好地调理人体经络之气，促进运动及神经功能重建[23-24]。

血脑屏障是维持脑微环境稳态、保证其正常功能的特殊结构，改善或维持血脑屏障的完整性是防止脑缺血再灌注的关键[5]。EOF 可反映红细胞渗透抵抗力，降低则导致血液黏滞度增加，红细胞的流动性、顺应性及通过微小血管的能力也随之降低，是导致血栓形成及微循环障碍，从而加重神经损伤的重要因素[25]。低频电针组血液黏滞度（高、中、低切）、血浆黏度、红细胞聚集指数、脑组织中伊文思蓝含量低于高、中频电针组，而最大、最小EOF 高于高、中频电针组，提示低频电针在改善血脑屏障通透性和血液流动性方面优于高、中频电针。

总之，采取不同频率电针治疗可维持脑缺血再灌注大鼠血脑屏障正常功能和通透性，并增强红细胞顺应性及流动性，为脑组织供应更多能量，减轻续发性脑损伤，这有利于受损神经元再生及功能恢复，提高学习记忆能力，且这一效应以低频电针最为突出。