分子生物学探索为食管癌靶向治疗开拓新思路

文图/《中国医药导报》 主笔 潘 锋

刘芝华教授做学术报告

第十五届“药明康德生命化学研究奖” 颁奖仪式2021 年12 月18 日以线上方式成功举办，设立于2007 年的“药明康德生命化学研究奖”旨在奖励从事生命化学及相关领域研究，并在科研创新、成果推广及高新技术产业化等方面取得突出成就的中青年科技人才。中国医学科学院肿瘤医院刘芝华教授潜心钻研食管癌分子生物学研究20 余年，致力于食管癌的基础和临床转化研究，绘制了全球最大规模的食管癌全基因组图谱，建立了食管癌精准分子分型体系，结合多维组学数据分析和功能机制，系统研究鉴定了多个与食管癌发生、转移、耐药相关的关键基因，为食管癌靶向治疗、预后判断及疗效预测提供了新的候选分子。凭借在肿瘤学领域尤其是食管癌分子分型和靶向治疗研究方面取得的突破进展，刘芝华教授获颁2021 年度“药明康德生命化学研究奖杰出成就奖”。

投入肿瘤学研究

20 世纪80 年代刘芝华考入北京大学，北京大学当时没有医学部，她选择了生物系，此后不断在分子生物学领域深耕，1996 年刘芝华在美国华盛顿州立大学植物生理学及植物分子生物学实验室完成博士后学习。“其实我学生物也是因为我对医学很有兴趣，觉得生物跟医学比较近，但我想学医的愿望一直在心里，一直到读完博士后我还是想着这事，我就觉得找工作的时候一定要找个医学单位。”刘芝华说。而在众多的医学细分领域中她当时隐约地感到肿瘤发病率高、死亡率高，是一个值得关注的疾病。回国后刘芝华首先选择了中国医学科学院肿瘤医院，一干就是20 多年。

刘芝华回忆道，20 多年前分子生物学在中国热度刚起，但即使在中国医学科学院肿瘤医院这样的国内顶尖机构，专业人员仍很少，研究水平也相对薄弱。刘芝华给时任分子肿瘤学国家重点实验室主任的吴旻院士写了一封信，表达了自己想做这方面研究的愿望。吴旻院士很快接纳了她，“你不懂的肿瘤学我们了解，但分子生物学我们不是特别熟悉，你正好过来，我们可以很好地互补一下。”情感上的支持、专业上的鼓励让刘芝华很快投入肿瘤研究工作中。

1998 年，在吴旻院士的推荐下刘芝华进入了陈竺院士领衔的“973”项目研究，与众多基础研究界的前辈研究员共同工作，和同辈切磋比拼，如饥似渴地学习肿瘤学知识。刘芝华说，当时自己只是个30 岁出头的年轻人，参与这么大的一个项目，尤其是看到周围人都特别优秀就“坐不住”了，因而拼命努力学习，不愿落在他人的后面。

绘制全球最大食管癌全基因组图谱

食管癌是一种发病率较高的常见肿瘤，其侵袭性强，预后差，病因复杂且机制多样。2020 年4 月《柳叶刀·胃肠病学和肝病学》发表的全球195 个国家地区的食管癌发病率、死亡率和可归因风险因素等统计数据显示，2017 年，全球食管癌新发病例47.3 万例，因食管癌死亡43.6 万例，中国这两个数字分别为23.5 万例和21.3 万例，均占到全球近一半。外科手术治疗食管癌已有百年历史，至今仍是食管癌传统的标准治疗方法之一，在肿瘤内科步入“精准治疗”的时代食管癌药物治疗手段依然十分有限。

在中国医学科学院肿瘤医院工作的20 多年时间里，刘芝华的研究主要围绕食管癌分子机制层层递进。食管癌有明显的地区发病率差异和家族聚集现象，刘芝华团队发现河南、山西等太行山地区是食管癌高发区，他们定期下现场调查，探索食管癌是否与遗传相关，希望能找到明确的遗传易感基因。虽然经过多年努力这一设想没有实现，但当时基本的摸排工作仍然增加了刘芝华对这一疾病的认知。“从现在的角度看，我们觉得同一个家族的人可能饮食习惯、生活方式、环境暴露方面更相似，导致了食管癌家族聚集性明显。尽管食管癌可能不存在像乳腺癌那样直接存在的一个易感基因，但仍有可能是多个基因相互作用的结果。”刘芝华说。

2015 年，刘芝华团队开始了大规模食管癌基因组图谱测序分析研究，此时国内也有不少团队开展了针对食管癌基因组的研究，但例数普遍仅有几十例到上百例且均取样自新鲜标本，仅做DNA 编码区外显子测序，食管癌基因图谱的全貌始终模糊不清，基因对食管癌患者的临床意义、病情发展和预后判断仍无法给出明确的指导。经过不懈努力，刘芝华团队最终完成了超过500 对患者的全基因组测序，研究团队不仅对能表达为蛋白质的外显子进行了测序，还对大量不表达的非编码区内含子进行了测序，研究论文于2020 年发表在Cell Research 杂志上，成为全球公开发表的最大规模食管癌基因组图谱研究。基于这些基因组信息刘芝华将食管癌进行了分子分型，发现具有NFE2L2（NRF2）通路突变及RTK-RAS-MYC 通路扩增的食管癌患者预后较差，其中具有NRF2 突变的患者尤其差，而没有相应基因突变及通路扩增的患者预后则相对较好，这一发现给新药研发带来了启示。

寻找食管癌新药靶点

与肺癌、乳腺癌相比，目前可用于食管癌治疗的药物屈指可数，这是由于发达国家食管癌疾病负担较轻，相较于肺癌、乳腺癌等高发病率的肿瘤，全球顶尖学术机构及制药企业对食管癌研究的投入都明显偏少，研究进展相对滞后。直到2019 年美国FDA 批准Keytruda（K药）用于食管癌治疗，食管癌才首次迎来新的免疫治疗选择，而靶向药则无一获批。在完成全球最大规模的食管癌基因图谱测序后，刘芝华意识到想要研发新的靶向药物，仅对食管癌进行基因层面的分型是不够，“要找药物的靶点其实主要是针对蛋白质，不管发现什么样的基因突变，最终起作用还是因为表达的蛋白不一样，而蛋白起作用还要通过各种不同的修饰。”刘芝华说。

刘芝华认为，食管癌或需要一种“多组学多层面”的分型，她带领团队在DNA 测序的基础上增加了DNA 甲基化、RNA 和蛋白质研究，但相较于DNA、RNA 测序蛋白质分析难度大得多。生物界遗传信息的传递有一个经典的“中心法则”，即遗传信息从DNA 传递给RNA，再从RNA 传递给蛋白质，前后两个传递过程分别被称为转录和翻译。但由RNA 翻译而来的“蛋白质”实则为一级结构的多肽，还需经折叠修饰过程才能成为有生物活性的蛋白质，而针对这些二级结构修饰过程的研究工作量非基因测序可及，还需要大量研究。

刘芝华介绍，泛素化是一种可逆的翻译后修饰过程，由E1 泛素激活酶、E2 泛素结合酶以及E3 泛素连接酶依次介导完成。发生泛素化修饰的底物蛋白通常会被蛋白酶体降解，但也有可能通过非降解途径影响蛋白活性、定位以及相互作用等。与泛素化过程相反，去泛素化酶通过清除、重编辑底物上的泛素链来逆转泛素化修饰。泛素化与去泛素化修饰广泛渗透到几乎所有的细胞生命活动当中，其异常调控与包括肿瘤在内的多种人类疾病密切相关。简言之，泛素化为细胞内蛋白质降解的过程，去泛素化则有助于蛋白质稳定。刘芝华认为，这两个对应的过程在肿瘤的发生发展、侵袭转移、耐药等方面都发挥着重要的作用，但泛素化与去泛素化的稳态失衡在人类肿瘤中的作用尚不明确。

2020 年1 月，刘芝华团队在Cell Reports 上发表的一项研究，揭示了泛素化与去泛素化过程在鳞状细胞癌发生发展中的关键作用。研究人员系统阐释了泛素化与去泛素化过程在调控ARID1A 稳定性，以及调控鳞状细胞癌发生发展中的关键作用。研究人员发现SDC2 是ARID1A 低表达促进鳞状细胞癌发生发展的下游环节，提出的将SDC2 中和抗体应用于ARID1A低表达的鳞状细胞癌患者的治疗方法具有潜在的临床应用意义。

2021 年3 月，刘芝华团队在Advanced Science 杂志上发表论文，阐述了去泛素化酶OTUD1 在肿瘤细胞凋亡与化疗耐药中扮演的关键角色。研究人员利用体内筛选模型发现，在顺铂耐受的肿瘤细胞中去泛素化酶OTUD1 表达量显著降低，通过对临床标本的进一步分析发现OTUD1 低表达与患者不良预后显著相关，该研究为食管鳞癌临床治疗开拓了新的思路。除了泛素化与去泛素化研究外，刘芝华团队还探索了丁酰化、乳酸化等修饰方式对食管癌的影响，旨在找到与不同蛋白修饰有关的靶点，以指导拓展食管癌新的诊疗方式。

刘芝华介绍说，他们团队根据多组学多层面的结果将食管癌分为4 类，结合多维组学数据和功能机制等系统研究，提出了更全景的食管癌个体化精准诊疗策略，并为食管癌靶向治疗、预后判断及疗效预测提出多个新的候选分子，包括一些已经获批可用于治疗其他肿瘤的“老药”也因此重获潜力，针对食管癌适应证已进入临床研究阶段。

刘芝华举例介绍，以细胞周期抑制剂为例，细胞周期是细胞生命活动的基本过程，而核心细胞周期机制活动也广泛存在于各类肿瘤，许多科学家试图寻找与细胞周期相关的药物。直到2015 年，全球首个细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinase，CDK）4/6 抑制剂Palbociclib 才获批在美国上市，2018 年进入中国用于乳腺癌治疗。

“科学家一直在想办法寻找细胞周期相关药物，前些年基本上都失败了，近年来乳腺癌领域出现了CDK4/6 抑制剂，针对雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阴性的乳腺癌患者效果很好。从分子机制看，乳腺癌ER 阳性可激活细胞周期蛋白（Cyclin）D1 高表达，而食管癌例也存在Cyclin D1 大量扩增，这意味着CDK4/6 抑制剂可能具备食管癌治疗潜力，但仍需临床试验进一步验证。”刘芝华说。

刘芝华坦言，总体而言全球食管癌研究空白仍多，由于肺癌、乳腺癌全球高发，世界各国科学家均投入了大量人力和资源进行研究，这些肿瘤目前已进入“精准治疗”时代。在中国进行食管癌研究一直要有一种“使命感”，全球50%的食管癌病例在中国，全世界做得最好的研究也在中国，需要中国学者继续投入更多的精力和关注。但国内现在的研究离真正解决患者的临床问题还有不少距离。食管癌各个环节都还有太多的问题要研究，但我们如果不坚持做下去，可能再过多少年食管癌的治疗依然还是没有好方法，因此一定要坚持做下去，相信不远的将来中国的食管癌患者将迎来更多的治疗选择。

肿瘤微环境影响乳腺癌疗效

乳腺癌居女性恶性肿瘤之首，其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是复发率和死亡率最高的乳腺癌亚型。TNBC 对激素疗法和靶向疗法均无效，目前以传统化疗为主要治疗手段，但效果并不理想。尽管癌症免疫治疗已进入快速发展时期，TNBC 的免疫治疗却仍举步维艰。

肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，其中固有免疫和适应性免疫细胞、基质细胞、癌细胞及其相互作用，构成精细的调节网络，共同决定癌症的发生和发展。早期IMpassion 130 临床试验表明，anti-PD-L1 抗体阿替利珠单抗（Atezolizumab）联合白蛋白结合型紫杉醇（Nab-paclitaxel），能够显著降低PD-L1 阳性TNBC 患者的无疾病进展或死亡风险，但近期的IMpassion 131 临床试验表明，阿替利珠单抗联合紫杉醇却无法使TNBC 患者获益。不同临床试验的结果差异提示不同的化疗药物可能会导致不同的肿瘤微环境特征，进而影响免疫检查点抑制剂的治疗效果，系统解析用药前后肿瘤微环境变化是理解免疫治疗及化疗药物作用机制，提高TNBC 整体治疗效果的关键。

2021 年10 月14 日，刘芝华教授、北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）张泽民教授、中国医学科学院肿瘤医院马飞教授和徐兵河教授合作，在Cancer Cell 以Research Article 形式在线发表了题为Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple negative breast cancer 的研究论文。研究人员收集了来自22 例TNBC 患者治疗前和治疗后的78 例配对样本，其中11 例接受阿替利珠单抗联合紫杉醇化疗，11 例接受紫杉醇单药化疗，通过整合单细胞转录组测序、T 细胞受体序列测序和染色质可及性测序，构建了TNBC 患者肿瘤微环境和外周血来源免疫细胞的高分辨率转录组和表观组动态图谱。该研究系统比较了响应患者和非响应患者的肿瘤微环境及外周血免疫特征，阐明了免疫细胞在不同治疗方案下的动态变化，揭示了anti-PD-L1免疫治疗联合紫杉醇化疗在TNBC中的作用机制。

通过比较联合用药组不同响应患者的肿瘤及外周血免疫细胞的组成差异，研究人员发现响应患者的肿瘤微环境富集了两群高表达CXCL13 的T 细胞，即CD8-CXCL13 和CD4-CXCL13，这两群细胞同时高表达T 细胞毒性和“耗竭”相关基因。为了进一步精确刻画不同免疫细胞的组成成分和比例变化与治疗效果的关联，研究人员设计了“预测指数”和“治疗指数”两个指数，通过对两个指数的分析研究人员发现更高基线水平的CD8-CXCL13 和CD4-CXCL13，能够预测更好的免疫治疗响应。此外，研究人员还发现响应患者的肿瘤微环境中富集了两群高表达CXCL9 和CXCL10 的促炎性巨噬细胞，且这两群促炎性巨噬细胞与CXCL13+T 细胞存在显著正相关。

通过比较化疗组和联合用药组免疫细胞的动态变化，研究人员发现与联合用药相反，紫杉醇单药化疗方案能够显著降低响应患者肿瘤微环境中的CXCL13+T 细胞，并导致具有免疫抑制功能的巨噬细胞在肿瘤微环境中富集。上述发现表明紫杉醇化疗方案可能会削弱核心抗肿瘤免疫细胞，而免疫检查点抑制剂则能够显著增加核心抗肿瘤免疫细胞，提示紫杉醇化疗方案与阿替利珠单抗联合应用时，会影响anti-PD-L1 抗体对TNBC 患者的治疗效果。该研究揭示了TNBC 患者对于anti-PD-L1免疫治疗敏感和耐药的分子机制，鉴定了关键免疫组分及其在免疫检查点抑制剂和紫杉醇化疗方案下的动态变化，阐明了紫杉醇化疗与阿替利珠单抗联合应用不能有效增加TNBC 患者治疗效果的原因。这一研究的科学发现为解析肿瘤及其他疾病中免疫细胞的动态调控机制，指导TNBC 患者临床分型以实现精准治疗以及开发新的临床检测与治疗手段提供了新的思路。（封面图为中国医学科学院肿瘤医院刘芝华教授）