苦金片对Poly（I∶C）刺激巨噬细胞病毒感染的影响

朱春雪 何嫣婕 何美娟 刘 晴 刘承雨 王一成 黄汉鹏

江苏大学附属医院呼吸与危重症医学科，江苏镇江 212000

病毒感染细胞后，Toll 样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）特异性识别病毒双链核糖核酸，激发炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等转录，出现炎症级联反应[1-3]；诱发内质网应激反应，导致相关基因如肌醇需求酶-1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）、拼接型X 盒子结合蛋白1（spliced X-box binding protein 1，xBP1s）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）等增加，引起或加重炎症、细胞自噬及凋亡[4-8]。

中药苦金片清热利咽、消肿止痛，但抗病毒作用鲜见报道。本研究采用病毒类似物Poly（I∶C）感染巨噬细胞体外模拟活病毒感染[9-10]，观察苦金片对感染过程中炎症因子、内质网应激反应相关基因及抗病毒因子如干扰素调节因子-3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）、β 干扰素（interferon-β，IFN-β）、干扰素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）、寡腺苷酸合成酶1（oligoadenylate synthetase 1，OAS1）、黏病毒耐药蛋白1（myxovirus resistance 1，MX1）的影响。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）（上海酶研科技有限公司）；Poly（I∶C）（APExBIO 公司，货号：B5551313 377BD）；高糖DMEM 培养基、胎牛血清（Gibco 公司，货号：8120281、42F335）；RNA 逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，批号：AJG2280A、AI80465A）；BCA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，生产批号：No.090120201103）；GAPDH、caspase-3、IL-6、TNF-α、TGF-β、xBP1s 兔抗鼠多克隆抗体（CST公司，货号：#9662、#2118、#12912、#11948、#3711、#40435）；CCK-8 试剂盒（东仁化学研究所，批号：FH783）；苦金片（上海医药集团青岛国风药业股份有限公司，批号：151003）。

1.2 研究方法

1.2.1 溶液制备 苦金片溶液：适量苦金片置磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered solution，PBS），59℃水浴5 h，室温下，以离心半径20 cm，3500 r/min 离心10 min，过滤，配成100 mg/ml 溶液，4℃保存。

Poly（I∶C）溶液：适量Poly（I∶C）溶于PBS 制成10 mg/ml 溶液，-20℃保存。

1.2.2 细胞培养 RAW264.7 细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM 中，37℃、5%CO2孵箱（Thermo 公司，150i 型）培养。

1.2.3 CCK-8 法检测RAW264.7 细胞活力 RAW264.7细胞按104个细胞/孔密度接种于96 孔板。为观察浓度对细胞的影响，设立苦金片不同浓度组（1、2、5 mg/ml）、空白组、对照组（加入等量培养基）、Poly（I∶C）（20 μg/ml）组，实验重复5 次，每100 μl 培养基加10 μl CCK-8孵育2 h，酶标仪（Thermo 公司，fc 型）检测450 nm 光密度（optical density，OD）值，细胞活性（%）=（给药组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）×100%。

1.2.4 细胞分组 RAW264.7 细胞接种于6 孔板并分为三组：对照组、Poly（I∶C）组与苦金片组（1 mg/ml），实验重复5 次。Poly（I∶C）组予Poly（I∶C）（20 μg/mL）刺激12 h，苦金片组在Poly（I∶C）刺激后，吸去上清，洗涤后予苦金片（1 mg/ml）刺激6 h，对照组不予特殊处理。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应 Trizol 试剂提取对照组、Poly（I∶C）组、苦金片组（1 mg/ml）细胞总RNA，逆转录为cDNA，PCR 反应条件：预变性95℃，30 s，1 个循环；95℃，5 s，40 个循环。引物序列（上海生工生物科技有限公司）见表1。将值标准化为Tublin 表达，结果用2-ΔΔCt表示。

表1 引物序列

1.2.6 蛋白质免疫印迹法 对照组、Poly（I∶C）组、苦金片组（1 mg/ml）细胞充分裂解后离心，收集总蛋白，加热变性后取20 μg 蛋白上样，凝胶电泳（80 V 30 min，110 V 1 h）后湿转到PVDF 膜（300 mA，2 h），室温封闭1.5 h，分别用GAPDH 抗体、IL-6 抗体、TNF-α 抗体、caspase-3 抗体、xBP1s 抗体1∶1000 稀释后4℃摇床孵育过夜（GAPDH 为内参）。清洗后与HRP 标记羊抗兔二抗（1∶100）室温孵育1.5 h，清洗曝光，Image J软件分析灰度。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 对结果作图并进行统计学分析，计量数据以均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦金片对Poly（I∶C）刺激下巨噬细胞活力的影响

Poly（I∶C）组细胞活力低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；苦金片不同浓度组高于Poly（I∶C）组，差异统计学意义（P ＜0.05）。苦金片不同浓度组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），后续实验中苦金片浓度选择1 mg/ml。见图1。

图1 苦金片对Poly（I∶C）刺激下巨噬细胞活力的影响（n=5）

2.2 苦金片对Poly（I∶C）刺激下相关因子mRNA 表达的影响

Poly（I∶C）组TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、MX1，IL-6、TNF-α、TGF-β，IRE1α，xBP1s，CHOP mRNA表达高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P <0.01）；与Poly（I∶C）组比较，苦金片组TLR3、IRF3、IFNβ、ISG15、OAS1、MX1 mRNA 表达上调，IL-6、TNF-α、TGF-β、IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表达下调，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P <0.01）。见图2。

图2 苦金片对Poly（I∶C）刺激下相关因子mRNA 表达的影响（n=5）

2.3 苦金片对Poly（I∶C）刺激下相关因子蛋白表达影响

Poly（I∶C）组IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表达高于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；苦金片组IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表达低于Poly（I∶C）组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 苦金片对Poly（I∶C）刺激下相关因子蛋白表达的影响（n=5）

3 讨论

呼吸道病毒可引起病毒性呼吸道疾病，临床发病率高[11-12]，探索有效的治疗临床意义重大。中药作为我国传统治疗药物，其中也存在多种抗病毒药物[13-16]。苦金片由苦地丁、金银花、黄芩、牛蒡子、桔梗、玄参、甘草组成，其中苦地丁生物碱可抗炎[17]；金银花中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸-A 等可拮抗流感病毒[18-19]；黄芩苷[20]、牛蒡子苷、牛蒡子苷元[21]等均有抗病毒功效。因此，笔者以Poly（I∶C）体外刺激巨噬细胞模拟病毒感染过程，探索苦金片的抗病毒作用。

TLR3 与配体结合活化会进一步激活IRF3、IFN-β等表达，诱导天然抗病毒反应[22-23]。本实验显示，经Poly（I∶C）孵育的巨噬细胞TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 表达升高，表明Poly（I∶C）可诱导巨噬细胞的抗病毒反应；苦金片组TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 高于Poly（I∶C）组，提示药物增强了细胞的抗病毒反应。

另一方面，病毒感染后建立的天然抗病毒信号也能诱导促炎性细胞因子表达，炎症因子释放过多会加速细胞溶解或凋亡[24]。本实验也发现与对照组比较，Poly（I∶C）处理后IL-6、TNF-α、TGF-β、caspase-3 表达增加，表明Poly（I∶C）诱导了严重的炎症反应，加速了巨噬细胞凋亡，苦金片组IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表达低于Poly（I∶C）组，提示苦金片可在一定程度逆转上述作用。

病毒感染后，大量病毒蛋白在内质网合成中使内质网处于应激状态，一旦超过内质网负荷能力，细胞凋亡信号通路便被激活[25]。实验发现，与对照组比较，Poly（I∶C）处理后内质网应激相关基因IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表达升高，与Poly（I∶C）组比较，苦金片组IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表达下调，提示内质网应激被过度激活，苦金片可明显减轻了这种应激状态。

综上，苦金片通过上调抗病毒基因表达、抑制炎症介质释放和内质网的过度应激，减少细胞凋亡，提高细胞存活率，提示苦金片具有抗病毒疗效，为其临床应用提供新的依据。