趋化因子受体2抑制剂在急性痛风小鼠模型中的作用研究

宣丹旦 赵力 薛愉 赵天仪 曹灵 万伟国

痛风是一类尿酸沉积性炎症性疾病。近年来,痛风和高尿酸血症继高血压、糖尿病、冠心病之后成为威胁人类健康的又一重大疾病,其患病率呈逐年上升趋势[1]。一项纳入2000～2014年发表研究的Meta分析结果显示,我国大陆痛风患病率为1.1%,高尿酸血症为13.3%[2]。我国2004年山东沿海地区痛风患病率为1.14%(近10年内增加了3倍)[3]。目前痛风急性发作控制手段主要为非甾体抗炎药(NSAIDs)、秋水仙碱、糖皮质激素,对于部分肾功能不全合并胃肠道出血或存在其他药物禁忌的患者治疗手段有限。因此,探索新的药物治疗靶点很有必要。中性粒细胞的入侵和活化是痛风急性炎症的重要环节,可在巨噬细胞启动炎症之后使炎症进一步扩大,而这一过程依赖于趋化因子。根据N端半胱氨酸的位置,趋化因子可分为4种亚型:CXC、CC、C或CX3C。CXC受体2(CXCR2)属于CXCR家族,是CXC趋化因子的主要受体,在中性粒细胞上的表达量最高[4]。由于对中性粒细胞的趋化作用,CXCR2与炎症性疾病密切相关。通过抑制CXCR2可以减轻小鼠急性胰腺炎[5]、环磷酰胺诱导的小鼠出血性膀胱炎[6]、小鼠实验性结肠炎[7]等。同样的,在关节炎小鼠模型中,也发现CXCR2-/-小鼠关节炎症、滑膜厚度及关节破坏程度均较WT小鼠减轻。提示CXCR2是BLT1(LTB4受体)对中性粒细胞招募的关键下游受体之一[8]。因此,我们推测CXCR2是痛风急性炎症过程中趋化中性粒细胞的关键受体之一，通过抑制CXCR2有望可以迅速减少中性粒细胞浸润,控制关节炎症,起到治疗作用。通过此研究我们希望探索痛风急性炎症治疗的新靶点,为今后药物研究提供新思路。

材料与方法

1.材料：21只C57BL/6雄性小鼠购自杰思捷实验动物公司,鼠龄均为6～8周,体质量约18～22 g,SPF级。

2.方法

(1)实验动物分组及处理：21只小鼠饲养于我院中心试验室,随机分为对照组、实验组及单钠尿酸盐(MSU)+SB225002干预组。小鼠急性痛风足掌模型分组：小鼠编号、称重,按随机数字表将12只6～8周龄的C57BL/6雄性小鼠分为上述3组(每组4只),对照组双侧足掌部注射生理盐水,实验组制作小鼠急性痛风足掌模型,干预组在制作小鼠痛风足掌模型同时腹腔注射CXCR2抑制剂SB225002 50 μg。小鼠急性痛风腹腔模型分组：小鼠编号、称重,按随机数字表将9只雄性C57BL/6小鼠,随机分为上述3组(每组3只),对照组腹腔注射生理盐水,实验组制作小鼠急性痛风腹腔模型,干预组在制作小鼠急性痛风腹腔模型同时注射CXCR2抑制剂SB225002 50 μg。

(2)小鼠足掌痛风炎症模型的建立：每只小鼠左侧后足掌部注射生理盐水,右侧后足掌部注射MSU晶体混悬液50 μl(20 mg/ml),于炎症高峰期8 h处死小鼠。游标卡尺测小鼠双侧足掌肿胀度(右后足掌厚度/左后足掌厚度)；小鼠足掌采用10%福尔马林固定,石蜡包埋切片行苏木素-伊红(HE)染色以评估小鼠关节炎症程度。

(3)小鼠急性痛风腹腔模型的建立：采用MSU 3 mg/0.5 ml腹腔注射进行造模,均于MSU注射4 h后(炎症最高峰)处死小鼠,行腹腔灌洗,取腹腔液并离心收集腹腔细胞和腹腔上清液。

(4)CXCR2抑制剂干预：按照说明书,依次将2%二甲基亚砜(DMSO)+30%聚乙二醇300(PEG300)+5%吐温80(Tween 80)+双蒸水(ddH2O)加入产品SB225002中,得到可以对小鼠腹腔注射的复合物,以50 μg：200 μl浓度腹腔注射。

(5)蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测足掌组织白细胞介素(IL)-1β水平：取小鼠右后足掌,加裂解液,组织匀浆,提取总蛋白,使用BCA系统进行蛋白初定量,利用BCA蛋白定量结果,均一化所有样本总蛋白浓度至3 mg/ml,常规方法转模,分别加入抗鼠IL-1β抗体、抗鼠GAPDH抗体,孵育后漂洗,加入抗兔IgG-HRP,孵育后增强化学发光显色,用Image J图像软件读取条带灰度值,并计算相关数据。

(6)流式细胞术检测腹腔液中性粒细胞数量及密度：收集腹腔灌洗液离心沉淀,采用F4/80-PerCP CY5.5和Ly6G-PE抗体标记中性粒细胞,使用流式细胞仪进行检测,Ly6GhighF4/80-细胞群即为中性粒细胞,收集样品体积,根据Ly6G+F4/80-细胞数量/细胞流式仪上样检测的液体体积计算密度。

(7)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腹腔液中IL-1β及趋化因子水平变化：将前述留取的腹腔灌洗液,按照ELISA试剂盒说明书步骤检测腹腔液中细胞因子水平。

结 果

1.急性痛风足掌模型3组小鼠右/左后足掌厚度比值、关节炎症程度及足掌组织IL-1β水平比较：0 h时,3组小鼠右/左后足掌厚度比值比较差异无统计学意义(P>0.05)。8 h时,实验组小鼠右/左后足掌厚度比值高于对照组,干预组低于实验组(P<0.05)。见表1。与对照组比较,实验组小鼠足掌关节炎症细胞浸润程度明显增加；与实验组比较,干预组小鼠足掌关节炎症细胞浸润程度明显下降,见图1。实验组(0.773)足掌组织IL-1β水平高于对照组(0.042),干预组(0.595)低于实验组。

图1 急性痛风足掌模型3组小鼠足掌病理检查结果(HE染色,×1)

表1 急性痛风足掌模型3组小鼠右/左后足掌厚度比值比较

2.急性痛风腹腔模型3组小鼠腹腔灌洗液中中性粒细胞密度和比例比较：实验组小鼠腹腔灌洗液中中性粒细胞密度和比例均高于对照组,干预组上述指标均低于实验组(P<0.001或P<0.05),见表2。

表2 急性痛风腹腔模型3组小鼠腹腔灌洗液中中性粒细胞密度和比例比较

3.急性痛风腹腔模型3组小鼠腹腔灌洗液中IL-1β及趋化因子水平比较：实验组小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、CXCL1、CXCL2、CXCL8水平均高于对照组,干预组小鼠腹腔灌洗液中CXCL1、CXCL2、CXCL8水平均低于实验组(P<0.05),而干预组和实验组小鼠腹腔灌洗液中IL-1β水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 急性痛风腹腔模型3组小鼠腹腔灌洗液中IL-1β及趋化因子水平比较

讨 论

早在1991年就有学者发现痛风患者关节滑液中CXCL8(即IL-8)明显升高[9]。CXCL8是一种趋化因子,属于CXC家族。在IL-1、TNF等作用下可诱导单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞等合成分泌CXCL8,可特异性趋化中性粒细胞进入炎症组织,发挥炎症作用。目前研究表明,急性痛风患者血清中可检测到炎症因子如IL-1β、IL-6及CXCL8水平升高[10]。提纯后的中性粒细胞经过MSU刺激与单核细胞共培养后同样也会出现IL-1β、CXCL8、IL-6和TNF-α水平升高[11]。而正如前文所述,作为CXCL8对应的受体CXCR2,已经在多种涉及中性粒细胞的研究中被发现可减轻中性粒细胞引起的急性炎症反应。

SB2250002是一种强效的选择性CXCR2拮抗剂,可以抑制IL-8与CXCR2的结合。为了探讨CXCR2拮抗剂对痛风急性炎症的影响,我们采用小鼠痛风足掌模型进行了实验。实验结果证实,应用CXCR2拮抗剂SB225002干预后可以减轻痛风小鼠模型足掌的肿胀程度,减少炎症细胞的浸润,下调IL-1β在足掌组织中的表达。为了更好地研究局部炎症因子及趋化因子水平,我们采用小鼠痛风腹腔模型再次进行实验，结果证实,应用CXCR2拮抗剂SB225002干预后可以减少腹腔灌洗液中中性粒细胞的比例及密度。CXCR2作为治疗急性痛风的靶点具有较大的潜力，目前CXCR2的已知配体有CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7和CXCL8[12]。为了研究CXCR2抑制剂干预对局部炎症水平及趋化因子的影响,我们取腹腔灌洗液进行了IL-1β、CXCL1、CXCL2、CXCL8检测。MSU刺激单核巨噬细胞分泌CXCL8,与CXCR2结合,刺激趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL8分泌,进一步召集中性粒细胞趋化至炎症部位,扩大炎症反应。本实验采用CXCR2抑制剂拮抗CXCR2后,减少了CXCL1、CXCL2、CXCL8的分泌,从而减少了中性粒细胞趋化。这些数据表明,抑制CXCR2可以减轻MSU导致的局部炎症。此外,在小鼠急性痛风足掌模型干预实验中,抑制CXCR2下调了IL-1β表达,但腹腔模型干预实验中腹腔灌洗液中IL-1β水平虽有下降,但差异无统计学意义,考虑可能与干预时间较短有关,拟在下一步试验中增加不同干预时间点的探索,以期判断更好的干预点。

本实验运用两种动物模型对CXCR2抑制剂在痛风急性炎症中的抑制作用进行验证,探讨了干预CXCR2靶点在小鼠急性痛风模型中的抑炎作用,并创新通过流式细胞仪检测中性粒细胞密度及比例来阐述中性粒细胞的局部浸润效果。CXCR2除了在急性炎症性疾病扮演重要角色外,可能在慢性疾病中也有作用。既往研究动脉粥样硬化的报道表明,部分CXCR2在慢性炎症的环境中可能由巨噬细胞表达[13]。我们不能排除中性粒细胞浸润时,少数组织驻留的巨噬细胞在介导慢性效应中发挥作用的可能性。另外CXCR2信号通路在外周炎症和神经损伤诱导的病理性疼痛状态中均可发挥作用[14]。CXCR2阻断可显著减少机械性痛觉过敏和减轻炎症性痛觉过度[15]，可能对于慢性痛风性关节炎的控制有所帮助。因此,在下一步试验中,我们还将探索CXCR2在慢性痛风性关节炎的作用,以期待未来CXCR2靶点在痛风性关节炎的治疗作用。