聚茶多酚包覆柚皮素纳米脂质体的制备、小鼠体内药动学和抑制肝细胞脂质沉积作用

胡 睿，阿斯亚·白依赛提，祁 荣

（1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000；2.北京大学医学部基础医学院药理学系，北京 100191；3.新疆克拉玛依市中心医院，新疆 克拉玛依 834000）

柚皮素（naringenin，NGN）是二氢黄酮类化合物［1］，主要存在于柑橘类水果中［2］。研究表明，NGN具有抗氧化、抗炎和免疫调节等药理活性［3-6］，并具有抑制肝纤维化作用，在体内和体外肝损伤模型中具有良好的保肝活性［7］。本课题组前期研究发现，NGN可通过抑制炎症相关通路的激活达到抑制油酸和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的HepG2细胞脂质沉积的作用，以及抗蛋氨酸-胆碱缺乏饲料诱导的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的作用［8］，这与常规通过调节血脂、改善胰岛素抵抗或控制肥胖等策略治疗NAFLD有所不同。

NGN水溶性和脂溶性均较差［9］，且其肠吸收受小肠上皮细胞膜表面P-糖蛋白外排作用的影响，生物利用度低，影响其药理活性。研究者尝试将NGN制备成纳米乳［10］、纳米粒［11］和自微乳［12］等制剂，以改善NGN的口服生物利用度并提高其药理作用。本课题组前期研究结果表明，将NGN制备成纳米脂质体（nanoliposomes，NL）可明显增加其口服吸收和抗NAFLD的药效作用［13］，但NL仍存在制剂储存稳定性差等问题［14］。对NL进行改进产生的新一代的脂质纳米颗粒，如固体脂质纳米粒和纳米脂质载体等［15］以及大分子包覆［16］均能增加NL的储存稳定性。

茶多酚具有抗氧化［17］、抗炎［18］和抗菌［19］活性，但其对光、氧气和温度等敏感，易降解为无生物活性的中间产物。因此，多酚生物利用度相对较低［20］。为解决多酚稳定性和生物利用度差的问题，有研究者将其聚合制备成纳米颗粒，用于开发新型功能性食品［21］；也将其作为功能性材料组装在各种模板表面［22］，使其兼具功能性和药理活性。

本研究将茶多酚聚合为聚茶多酚（poly-tea polyphenol，PTP）并包覆在NGN-NL表面制成PTP包覆的NGN-NL（PTP@NGN-NL），研究PTP包覆是否增加NGN-NL制剂稳定性，以及是否提高NGN的抗肝细胞脂质沉积作用，为开发治疗NAFLD临床新药奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 药品、主要试剂和仪器

NGN（纯度93%），日本TCI公司；茶多酚（纯度98%），上海晶都生物有限公司；胆固醇和磷脂，上海阿拉丁生化科技有限公司；肝素，北京华中海威基因科技有限公司；油酸，日本TCI公司；LPS，上海源叶生物科技有限公司；水合氯醛，国药集团化学试剂北京有限公司；胎牛血清和高糖DMEM培养基，北京全式金公司；甘油三酯测定试剂盒（批号：R21738-96T）；北京中生北控生物科技公司；碳酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化钠、三氯甲烷、甲醇、氯化钾、氯化钙、碳酸钙、盐酸和氢氧化钠，北京精细化工厂。

超纯水制备器，美国Millipore公司；Agilent1260高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC），美国安捷伦科技有限公司；紫外扫描分析系统，美国Kodak公司；pH计，意大利Hanna公司；1/1000电子天平，美国Ohaus公司；Zetasizer Nano分析仪，英国Malvern Instruments公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器；KQ-100DE型数控超声波清洗器，郑州明天仪器设备有限公司；台式冷冻高速离心机5810 R，德国Eppendorf公司；-80℃超低温冰箱和孵箱，日本Sanyo公司；涡旋混合器，北方同正生物技术发展公司；光学显微镜，德国Leica公司和超净工作台，北京长城空气净化公司；Tecnai TF30透射电镜（transmission electron microscope，TEM），美国FEI公司。

1.2 动物和细胞

18只8周龄雄性C57小鼠（北京大学医学部动物部），体重24～26 g，使用许可证号：SYXK（京）2016-0041，伦理学批准文号：LA2016035，饲养于SPF级屏障实验室。所有动物正常饮食饮水，在室温（18～22℃），湿度45%～55%，12 h昼夜交替条件下饲养。人肝癌HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.3 NGN-NL和PTP@NGN-NL的制备

NGN-NL的制备：磷脂225 mg、胆固醇25 mg和NGN 25 mg置茄形瓶中，加3.00 mL溶剂（甲醇∶氯仿=2∶1）溶解混匀，旋转蒸发30 min（37℃，100 r·min-1）至成膜。吸取3.00 mL PBS水化，冰浴状态下超声至泛淡蓝色乳光，即得NGN-NL。将制备好的NGN-NL过0.22 μm滤膜，取滤液于5 mL EP管中4℃保存。NL的制备除不加NGN外，其余制备步骤与NGN-NL一致。

PTP@NGN-NL的制备：茶多酚粉末30 mg溶解于1 mL水中，吸取3.00 mL NGN-NL于西林瓶中，在300 r·min-1磁力搅拌下，将1.00 mL茶多酚溶液缓慢加入西林瓶中，用NaOH 0.01 mol·L-1调节溶液至pH8.5，持续搅拌反应24 h。用去离子水在9391×g，10 min离心3次，洗去未聚合的多酚和游离的NGN，4℃下保存。PTP@NL载体的制备：除将NGN-NL替换为NL外，其余制备步骤均同PTP@NGN-NL制备。

1.4 NGN-NL和PTP@NGN-NL表征检测

1.4.1 粒径、Zeta电位测定及表观形态观察

分别精密吸取100 μL PTP@NGN-NL或NGN-NL于10.00 mL容量瓶中，取适量去离子水振摇混匀后，稀释至刻度摇匀。吸取1.00 mL上述样品，用马尔文粒径仪测定粒径以及Zeta电位；将样品置小烧杯中，用镊子夹住铜网边缘并在样品溶液中浸润数秒，干燥后用透射电镜观察样品表观形态。

1.4.2 HPLC法测定包封率和载药量［13］。

首先吸取1.3制备的NGN-NL或PTP@NGN-NL 100 μL，置10.00 mL容量瓶中，用甲醇定容，超声（频率：40 kHz，功率：100 W）破乳10 min，计算NGN-NL或PTP@NGN-NL中NGN的质量即为总含药量（N，g）。另吸取200 μL NGN-NL，超速离心（84 518×g，2 h，4℃）后，精密吸取上清液100 μL，测定NGN浓度，即为NGN-NL中游离药物含量（Cfree，g·L-1）；或吸取1.00 mL PTP@NGN-NL，离心（9391×g，10 min，4℃）后，吸取上清于EP管中，再补充1.00 mL去离子水于PTP@NGN-NL中，重复离心3次，合并上清液（总体积为V），测定NGN浓度，即为PTP@NGN-NL中的Cfree。计算包封率和载药量。包封率（%）=（N-Cfree×V）/N×100%，载药量（%）=（N-Cfree×V）/（N+W）×100%，式中，W为药物载体总量（g）。

1.5 HPLC法测定PTP@NGN-NL的储存稳定性

分别平行制备3份NGN-NL和PTP@NGN-NL，各取2.00 mL置相同体积EP管中，加氮气隔绝空气，封口膜封EP管管口，分别保存在室温和4℃，于第0，3和7天取样，按1.4.2处理，测定NGN含量，计算载药量，以载药量反映制剂的储存稳定性。

1.6 HPLC法测定PTP@NGN-NL在模拟胃液和肠液中溶出率

据2015版《中国药典》［23］制备模拟胃液：取稀盐酸1.64 mL，加水稀释至100.00 mL，使溶液pH值为1.2；模拟肠液制备：取25.00 mL 0.2 mol·L-1磷酸二氢钾溶液，加入0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液11.80 mL，用水稀释至 100.00 mL，摇匀，即得，使溶液pH值为6.8。

精密吸取9.00 mL配置好的模拟胃液，平行3份，分别加入1.00mLNGN，NGN-NL或PTP@NGNNL溶液（均7 g·L-1），放入摇床中，37℃，100 r·min-1振动，分别于0，2和4 h取样品溶液200 μL，加入氢氧化钠中和至pH=7，13 523×g离心30 min后，取上清用HPLC法测定NGN量，计算胃液溶出的NGN与加入量的比例（%）以反映制剂在胃液中的稳定性。

精密吸取配置好的模拟肠液9.00 mL，平行3份加入1.00 mL NGN，NGN-NL或PTP@NGNNL溶液（均7 g·L-1），分别在0，2和4 h取样品溶液200 μL，样品溶液经13 523×g离心30 min，取上清用HPLC法测定NGN的量，计算肠液溶出的NGN与加入量的比例（%）以反映制剂在肠液中的稳定性。

1.7 HPLC法测定PTP@NGN-NL的体外释放

首先活化透析袋（分子截留量为8000～14000ku），随后在透析袋中加入相当于含1 mg NGN的NGN，NGN-NL和PTP@NGN-NL样品溶液，用水稀释至1 mL，用透析夹将透析袋两端夹紧固定，防止液体流出。以PBS缓冲液（含0.25%吐温80）为释放介质，将透析袋置200.00 mL 37℃恒温释放介质中磁力搅拌（300 r·min-1）。分别在0.5，1，2，4，8，12和24 h吸取1.00 mL透析袋外的释放介质，并补充等体积新鲜释放介质。采用HPLC法测定各时间点所取样品中NGN浓度并计算累积释放百分率。

1.8 PTP@NGN-NL的小鼠体内药动学

1.8.1 分组和样制备

18只小鼠，分为NGN-NL 12.5，25.0 mg·kg-1和PTP@NGN-NL 12.5 mg·kg-1组（剂量为相当于NGN的含量），每组6只，ig给药。给药前禁食12 h，自由饮水。每组再分为2个亚组，亚组1在给药后0.083，0.25，1，6和12 h眼眶取血100 μL；亚组2在给药后 0.167，0.5，2，8 和 24 h 眼眶取血 100 μL。血液样品置肝素处理的离心管中，1502×g离心10 min，取上清得血浆样品，冷冻保存于-20℃。

1.8.2 血浆样品处理和药动学参数测定

β-葡萄糖醛酸酶溶液制备：精密称取10 mg β-葡萄糖醛酸酶，加入2.00 mL PBS溶液，制得浓度5000 kU·L-1的β-葡萄糖醛酸酶溶液。

酶解样品制备：将冰冻血浆进行解冻，精密吸取40 μL于离心管中，随后加入β-葡萄糖醛酸苷酶溶液50 μL，涡旋1 min，在37℃恒温水浴条件反应1 h后，加入1.00 mL甲醇，涡旋1 min，1502×g，4℃离心10 min，取上清液于离心管中，在40℃水浴条件下用氮气吹干。在吹干样品中加入0.10 mL流动相进行溶解，涡旋1 min，使其混匀，1502×g，4℃离心10 min，吸取上清液用0.45 μm针孔式过滤器过滤，取上清液，采用HPLC测定血浆中NGN浓度［13］。采用DAS 2.0软件对小鼠血药浓度进行非房室模型拟合，得药动学参数。

1.9 MTT法确定HepG2细胞PTP@NGN-NL安全浓度

将HepG2细胞接种在96孔板中〔每孔（5～6）×104个细胞〕，培养过夜待细胞贴壁后用DMEM培养基处理12 h，每组设6个平行孔。分为空白对照组、细胞对照组、模型组（加含油酸0.3 mmol·L-1和LPS 2.5 mg·L-1的 DMEM溶液 0.20 mL）、模型+NGN 100 和 200 μmol·L-1组、模型 +NGN-NL 100 和 200 μmol·L-1组、模型+PTP@NL 100 和200 μmol·L-1及模型+PTP@NGN-NL 载体 100 和200 μmol·L-1组。模型组分别加含相应终浓度载体溶液0.20 mL。细胞置37℃孵箱（相对湿度90%，CO2浓度5%）培养24 h后吸弃培养液。加入DMEM稀释的MTT溶液（5.0 g·L-1）0.02 mL继续置37℃细胞培养箱中培养。4 h后吸弃上清，加入0.15 mL DMSO，37℃避光100 r·min-1振动条件下反应8 min，待蓝色结晶甲臜完全溶解后，用酶标仪在560 nm波长处读取溶液吸光度（A560nm）值。细胞存活率（%）=（药物组A560nm-空白对照组A560nm）/（细胞对照组A560nm-空白对照组A560nm）×100%。以细胞存活率≥80%对应的浓度为安全药物浓度［8］。

1.10 试剂盒测定HepG2细胞甘油三酯含量

将HepG2细胞接种在6孔板中〔每孔（5～6）×105个细胞〕，每组设6个平行孔。培养过夜待细胞贴壁后用DMEM培养基处理12 h，分为细胞对照组、模型组（加含油酸0.3 mmol·L-1及LPS 2.5 mg·L-1的DMEM溶液 1 mL）、模型+NGN 100和200 μmol·L-1组、模型+NGN-NL 50 和 100 μmol·L-1组、模型+PTP@NL 载体 100 和 200 μmol·L-1组和模型+PTP@NGN-NL 50 μmol·L-1组。处理组分别加入含相应终浓度溶液1.00 mL，孵育24 h。用1×PBS洗3次，0.5 mL胰酶消化1 min，吸弃胰酶，加入1.00 mL空白培养基反复吹打细胞，直至细胞完全脱落并装在EP管中。4℃，375×g离心10 min，弃上清，加入1.00 mL 1×PBS再离心，再加入1.00 mL 1×PBS，并将其转移至新玻璃管中，加入2∶1氯仿/甲醇溶液（2∶1）4.00 mL，封盖。涡旋1 min，直至充分混匀，4℃预冷，375×g离心30 min将水相和油相分离，弃最上层水相，取下层有机相用氮气吹干后加入0.50 mL 3%Triton X-100（V/V）溶液，涡旋使玻璃管壁上脂质完全溶解，再将其置55℃恒温摇床，100 r·min-1振荡2 h使脂质完全溶解。用试剂盒测定样品中甘油三酯含量（μmol·L-1）。

1.11 统计学分析

实验结果数据以±s表示，实验中所有统计学分析均采用GraphPad Prism 6.01软件进行，组间比较采用one way-ANOVA检验，两两比较采用t检验。P＜0.05为具有差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PTP@NGN-NL的粒径、Zeta电位、包封率和载药量

NGN-NL及PTP@NGN-NL均为圆整的球状粒子（图1），马尔文粒径仪测试结果与电镜检测结果基本一致（表1）。NGN-NL和PTP@NGN-NL的粒径分别为125±4和（159±6）nm；Zeta电位分别为-4.3±0.0和（-23.0±2.5）mV；包封率分别为（94.8±1.2）%和（93.4±0.6）%，载药量分别为（9.1±0.0）%和（8.2±0.1）%。其中PTP@NGN-NL的粒径明显大于NGN-NL（P＜0.01），表明PTP已包覆在NGN-NL表面，提示NL作为基底膜材，可使NGN-NL充分包载在PTP囊壳内；PTP包覆后Zeta电位绝对值增加（P＜0.01），表明PTP包覆能明显增加NGN-NL制剂稳定性；同时PTP包覆不会影响NGN-NL包封率，但因使用囊材质量增加导致载药量略微降低。

Fig.1 Representative transmission electron microscope(TEM)image of naringenin nanoliposomes(NGN-NL)(A)and poly-tea polyphenol coated NGN-NL(PTP@NGN-NL)(B).

Tab.1 Characterizations of NGN-NL and PTP@NGN-NL measured by Marlvern laser particle size analyzer and hith performance liquid chromatography（HPLC）

2.2 PTP@NGN-NL的稳定性

2.2.1 储存稳定性

与0 h相比，室温储存至第3天和第7天（图2），NGN-NL和PTP@NGN-NL的载药量均明显降低（P＜0.01）；4℃储存至第3天，二者的载药量均无明显变化，储存至第7天载和PTP@NGN-NL药量均明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。表明 NGN-NL和PTP@NGN-NL在4℃时相较室温更稳定。

Fig.2 Storage stability of NGN-NL and PTP@NGN-NL at room temperature（A）and 4℃（B）measured by HPLC.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the coresponding 0 h group.

2.2.2 在模拟胃液和模拟肠液中稳定性

在模拟胃液中，与0 h相比（图3），4 h时NGN,NGN-NL和PTP@NGN-NL组NGN含量均显著降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），PTP@NGN-NL组 NGN含量显著高于NGN原料药组（P＜0.05）和NGN-NL组（P＜0.05），表明PTP@NGN-NL在胃液中稳定性高于NGN原料药和NGN-NL。在模拟肠液中，与0 h相比，4 h，NGN，NGN-NL和 PTP@NGN-NL组NGN含量均显著降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），NGN原料药与NGN-NL组相当，PTP@NGN-NL组明显高于NGN-NL和NGN原料药组（P＜0.05）。表明PTP@NGN-NL在胃肠液中稳定性均优于NGN-NL。

Fig.3 Stability of NGN，NGN-NL and PTP@NGN-NL in simulated gastric fluid（A）and simulated intestinal fluid （B）measured by HPLC.x± s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding 0 h of the same group；#P＜0.05，compared with NGN group at the same time；ΔP＜0.05，compared with NGN-NL group at the same time.

2.3 PTP@NGN-NL的体外累积释放率

如图4所示，NGN-NL和PTP@NGN-NL中NGN的24 h累积释放率明显高于NGN原料药（P＜0.01），提示NL和PTP包覆均能增加NGN原料药体外释放；与NGN-NL相比，PTP@NGN-NL释药曲线中24 h时NGN含量仍在缓慢上升未达到稳态（P＜0.01），表明PTP包覆增加了 NGN-NL缓释作用。

Fig.4 In vitro accumulative release profile of NGN，NGN-NL and PTP@NGN-NL detected by dialysis bag method.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with NGN group；##P＜0.01，compared with NGN-NL group.

2.4 PTP包覆对NGN-NL小鼠体内药动学的影响

如图5所示，NGN-NL组和PTP@NGN-NL组均在0.083 h（约5 min）达Cmax值，均出现双峰，说明药物在体内出现了肝肠循环现象。如表2所示，NGN-NL 12.5 mg·kg-1组与NGN-NL 25.0 mg·kg-1组相比，药动学参数 AUC 和Cmax均有明显差异（P＜0.01，P＜0.05），PTP@NGN-NL 12.5 mg·kg-1组与 NGN-NL 12.5 mg·kg-1组药动学参数AUC，t1/2和Cmax均无明显差异，表明PTP包覆可能不影响NGN-NL的体内药动学。

Fig.5 Plasma NGN-time curves of NGN-NL and PTP@NGN-NL after single ig administration in mice.Male mice were ig given NGN-NL 12.5，25.0 mg·kg-1or PTP@NG-NL 12.5 mg·kg-1，and plasma concentrations of NGN were measured by HPLC.±s，n=3.

Tab.2 Pharmacokinetic parameters of NGN-NL and PTP@NGN-NL in mice

2.5 PTP@NGN-NL对HepG2细胞脂质沉积的影响

2.5.1 PTP@NGN-NL安全浓度

MTT结果（表3）可见，NGN 100，200 μmol·L-1、NGN-NL 100，200 μmol·L-1、PTP@NL载体100，200 μmol·L-1和 PTP@NGN-NL 100，200 μmol·L-1组HepG2细胞存活率均高于80%。

Tab.3 Cell viability of HepG2 treated with NGN formulations by MTT

2.5.2 PTP@NGN-NL对HepG2细胞甘油三酯含量的影响

与细胞对照组相比，模型组细胞甘油三酯含量显著增加（P＜0.01），模型+NGN-NL 50 μmol·L-1与模型+NGN 200 μmol·L-1组甘油三酯含量相当，模型+PTP@NGN-NL 50 μmol·L-1组甘油三酯含量明显低于模型+NGN-NL 50 μmol·L-1组（P＜0.05）（表4），表明NGN-NL抑制肝细胞脂质沉积作用优于NGN原料药组，且PTP可增加NGN降低肝细胞脂质沉积作用。同时，模型+PTP@NGN-NL组与模型+NGN 200 μmol·L-1组甘油三酯含量相当，表明PTP也具有抑制细胞脂质沉积的作用。

Tab.4 Effects of NGN formulations on triglycerides(TG)in HepG2 cells induced by oleic acid and lipid polysaccharide.

3 讨论

本研究结果表明，茶多酚不仅因氧化成膜增加NGN-NL的稳定性，还能增加NGN-NL的缓释作用，还可因其药理作用增加NGN抗肝细胞脂质沉积作用。

PTP含有邻位酚羟基，在pH驱动下可自行发生氧化聚合反应，贾鑫教授课题组前期研究结果表明，多酚氧化聚合24 h可达到聚合稳态［24］。因此，本课题在上述条件下制备了PTP@NGN-NL，通过电子显微镜及马尔文粒径仪均观察到PTP在NGN-NL表面形成了约20 nm厚的薄膜，这一结果与文献报道结果基本一致［25］。储存稳定性和胃肠液稳定性实验结果表明，PTP包覆后，NGN-NL稳定性明显增加。

体外释放实验结果表明，在肠液中释放24 h时，NGN-NL累积释放率比原料药高2.7倍，达85.2%；PTP@NGN-NL累积释放率为68.1%，且释药曲线中NGN含量还在缓慢上升尚未达到稳态，表明PTP包覆增加了NGN-NL在肠液中的缓释作用。

本研究肝细胞脂质抽提结果表明，PTP@NL空载体（相当于给予PTP@NGN-NL 100 μmol·L-1的载体量）与NGN 200 μmol·L-1具有相似的抗油酸和LPS诱导的HepG2细胞脂质沉积作用，说明PTP具有抑制肝细胞脂质沉积药理活性。NGN-NL抑制肝细胞脂质沉积的作用是NGN原料药的4倍，且PTP@NGN-NL具有比NGN-NL更好的抑制肝细胞脂质沉积的作用。上述结果表明，NGN与PTP存在协同抗肝细胞脂质沉积作用。

本课题组前期研究结果表明，NGN-NL抗NAFLD 最低有效剂量为 25 mg·kg-1［13］。因此，在小鼠药动学实验中，以NGN-NL 25 mg·kg-1体内药动学行为做为参考。若PTP与NGN存在协同药理活性，PTP@NGN-NL12.5 mg·kg-1也许可增强NGN抗NAFLD作用。因此，分别选用NGN-NL 12.5和25.0 mg·kg-1及PTP@NGN-NL12.5 mg·kg-1观察PTP包覆对NGN-NL体内吸收的影响。NGN-NL 12.5 mg·kg-1与PTP@NGN-NL12.5 mg·kg-1的AUC（0-t）无明显差异，表明PTP包载不影响NGN-NL体内吸收。

综上所述，PTP包覆不影响NGN-NL的包封率、载药量及体内吸收，可增加其的稳定性，并具有比NGN-NL更好的缓释作用；PTP可与NGN-NL协同抑制肝细胞脂质沉积。提示PTP在体内可能具有与NGN协同抑制NAFLD的作用。