天麻素对高脂和高胆固醇饮食致小鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用

李 琳，张 营，赵晟珣，肖方喜，张林英，刘 菊

（武汉市第一医院1.综合医疗科，3.内分泌科，湖北 武汉 430022；2.长江航运总医院心内科，湖北 武汉 430010）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常见的慢性肝病，影响全球25%人口。NAFLD包括一系列肝病变，包括单纯性肝脂肪变性和与纤维化进展相关的小叶炎症为特征的非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）以及可能导致肝功能衰竭或肝细胞癌的肝硬化［1］。肥胖、2型糖尿病、代谢综合征、血脂异常和心血管疾病在NAFLD中很常见，尽管肝病变相关死亡率在增加，但心血管疾病仍是NAFLD患者死亡的主要原因，尤其是NASH患者［2］。NAFLD的病理生理学极其复杂，其进展的分子机制尚未完全阐明。研究表明，几乎所有NAFLD患者均存在肝胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），且IR的严重程度与NAFLD病情进展密切相关［3］。尽管在治疗靶点鉴定和治疗策略方面取得了很大进展，但目前仍无可有效治疗NASH药物获批。基于此，寻找有效的中药或生物活性化合物的治疗NASH的研究越来越引起人们关注。

天麻（Gastrodia elataB1.）又名赤箭，是兰科天麻属多年生草本植物，以其根茎入药。药典记载天麻味甘，性微湿，入肝经，具有平肝熄风、祛风定惊的功效。天麻素（gastrodin，GSTD）是一种从天麻根茎中提取的低分子量生物活性化合物，临床用于治疗眩晕、癫痫和椎基底动脉供血不足等神经系统疾病。据报道，癫痫发作时，GSTD通过升高神经递质γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）和抑制负责GABA代谢或降解的GABA氨基转移酶或琥珀酸半醛还原酶，减少神经元异常和过度放电［4］。在帕金森病中，GSTD通过上调核红细胞2 p45相关因子（nuclear erythroid 2 p45-related factor，Nrf）表达，减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，降低病理刺激后神经元和脑组织中促炎细胞因子水平，抑制多巴胺神经元凋亡，减缓了帕金森病的进展［5］。在认知功能障碍和脑缺血再灌注损伤等其他疾病中，GSTD被认为通过与上述类似的机制起作用，影响神经递质释放、氧化应激或细胞凋亡［6］。关于GSTD对NAFLD的保护作用的研究报道很少。近年来，GSTD已被证明可改善由高脂饮食或胆管结扎引起的肝细胞促炎症反应和纤维化［7］。然而，GSTD对高脂和高胆固醇（high fat and high cholesterol，HFHC）饮食引起的NASH的治疗作用和机制尚不清楚。本研究探讨GSTD对HFHC饮食诱导的NASH小鼠中的保护作用和机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

HFHC饲料（14%蛋白质、42%脂肪、44%碳水化合物和0.2%胆固醇）购自中国南通特菲洛饲料科技有限公司；GSTD（纯度＞98%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸二甲双胍片（metformin hydrochloride，Met）（批准文号：国药准字H20023371）购自中美上海施贵宝制药有限公司；谷丙转氨酶（glutamic pyruciv transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、胆固醇（cholesterol，TC）和游离脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；胰岛素酶联免疫测定试剂盒购于江苏晶美生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、RIPA组织蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；非冻型组织RNA保存液购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol总RNA抽提试剂购自北京百泰克生物技术有限公司；逆转录cDNA合成试剂盒和2x SYBR qPCR扩增试剂盒均购自美国Thermo Scientific公司；一抗：兔抗小鼠胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）多克隆抗体和磷酸化IRS1（phospho-IRS1，p-IRS1）多克隆抗体购自美国Affinity公司；兔抗小鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）多克隆抗体、p-Akt单克隆抗体和β肌动蛋白单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗小鼠NF-κB单克隆抗体和p-NF-κB多克隆抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；二抗：HRP标记山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG抗体购自南京巴傲得生物科技有限公司。血糖仪（安稳+型）购自三诺生物传感股份有限公司；LightCycler96实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；Infinite 200 PRO型多功能酶标仪购自奥地利TECAN公司；AG 22331型低温离心机购自德国Eppendorf公司；蛋白电泳和电转移装置购自美国Bio-Rad公司；Amersham Image 600凝胶成像仪，美国GE公司；T10B型电动组织匀浆机购自德国IKA公司；IX53PIF型倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯株式会社。

1.2 动物分组和给药

6周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重18～20 g，购自于武汉华联科生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2017-0012，所有小鼠饲养于SPF级环境，给予标准饮食和饮水，光照/黑暗环境循环为12 h。动物实验室内温度保持在20℃～25℃，相对湿度保持在50%～60%。动物实验由武汉市第一医院实验动物伦理委员会审查批准，动物伦理审核编号2018012。小鼠适应性喂养1周后，按体重随机分为6组，每组8只：正常对照组、模型组、模型+GSTD 12.5，25.0 和50.0 mg·kg-1组及模型+Met 100 mg·kg-1组（阳性对照，Met给药剂量参考文献［8］）。除正常对照组外，其余各组小鼠给予HFHC饮食24周建立NASH模型；第17周开始，HFHC饮食的同时ig给与相应分组药物，每天1次，连续8周。模型组和正常对照组ig给予等体积生理盐水。

1.3 样本制备和肝湿重、体重和肝指数检测

1.2分组小鼠，GSTD和Met末次给药2 h后，称量小鼠体重。尾静脉采血，血糖仪检测血糖。眼球采血后处死小鼠，血样不抗凝，静置1 h后，3000×g常温离心15 min，分离血清，分装保存于-80℃。采血后，分离完整肝组织，称量肝湿重，计算肝指数。肝指数=肝重（g）/体重（g）×100。

取小鼠部分肝组织，0℃生理盐水中匀浆，制成10%肝组织匀浆；部分肝组织采用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，厚度5 μm；部分肝组织经OCT包埋剂包埋后，恒冷箱切片机切片（-22℃），片厚10 μm，贴于预处理的载玻片上，-20℃冰箱保存；另取30 mg肝组织浸入1 mL非冻型组织RNA保存液中，置4℃冰箱过夜后，从RNA保存液中取出组织块，转移到-80℃冰箱保存；剩余肝组织经液氮速冻后，-80℃冰箱保存。

1.4 HE、Masson和油红O染色观察肝组织结构损伤、胶原增生和脂质沉积

取1.3制备的石蜡切片，脱蜡后进行HE和Masson染色，光学显微镜明场状态下HE染色观察肝组织形态、脂肪变性和炎症浸润情况；Masson染色观察肝组织胶原纤维增生情况。参照文献［9］标准对HE染色结果进行NAFLD活动度积分（NAFLD activity score，NAS）评定。每组8只小鼠，每只小鼠HE拍照视野共15个，NAS以每只小鼠15个视野3部分〔脂肪变性（0～3）、小叶炎症（0～3）和肝细胞气球样变（0～2）〕评分求和的均值表示。另取1.3制备的冰冻切片进行油红O染色，光学显微镜明场状态下拍照，观察肝组织内脂质沉积情况。

1.5 ELlSA检测血清胰岛素水平并计算胰岛素抵抗指数

取1.3中分离的血清样本，按ELISA说明书检测胰岛素水平，胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=血清葡萄糖浓度（mmol·L-1）×血清胰岛素浓度（mIU·L-1）/22.5。

1.6 化学显色法检测血清GPT和GOT活性

取1.3中分离的血清样本，参照试剂盒说明书检测肝功能指标GPT和GOT活性。

1.7 化学显色法检测肝组织TG，TC和NEFA水平

取1.3中制备的肝组织匀浆，5000×g4℃离心10 min，收集上清，按试剂盒说明书检测肝组织TG、TC和NEFA水平。

1.8 化学显色法检测肝组织MDA和GSH水平及SOD和CAT活性

取1.3中制备的肝组织匀浆，5000×g4℃离心10 min，收集上清，按试剂盒说明书检测MDA和GSH水平及SOD和CAT活性。

1.9 实时定量PCR检测肝组织中脂质合成、氧化、炎症因子和纤维化相关基因mRNA表达水平

取1.3中RNA保存液处理后的肝组织，Trizol法抽提总RNA，按照试剂盒说明书采用RevertAid first strand cDNA synthesis kit将RNA逆转录为cDNA。将模板、引物、水以及2x SYBR qPCR Master Mix按比例混合进行RT-PCR，使用LightCycler96实时荧光定量PCR仪上机进行扩增检测，反应条件为95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。用2-△△Ct表示待测基因mRNA相对水平。实时定量PCR引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.10 Western印迹法检测肝组织胰岛素及炎症信号通路相关蛋白磷酸化水平

取1.3中经液氮速冻后保存的肝组织30 mg，加入2 mL RIPA裂解液4℃匀浆，按照蛋白提取试剂盒说明书提取肝组织总蛋白，BCA比色定量蛋白。取40 μg蛋白样品与5×SDS上样缓冲液（体积比4∶1）混匀，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，蛋白电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗（IRS，p-IRS：1∶1000；Akt，p-Akt：1∶2000；NF-κB，p-κB：1∶1500；β肌动蛋白：1∶5000）4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗（1∶10 000），37℃室温孵育1 h，经ECL底物化学发光显影，结果用Quantity One软件定量分析条带积分吸光度值，以p-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB积分吸光度比值表示待测蛋白磷酸化水平。

1.11 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行分析实验结果数据，满足方差同质性的数据以±s表示。单因素方差分析比较各组间差异，组间两两比较采用Tukey法，P＜0.05为差异有统计学意义。采用Kruskal-Wallis H检验，分析NAS评分结果，组间两两比较采用Mann-Whitney U检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝湿重、体重和肝指数的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠在HFHC饮食诱导24周后，肝湿重和体重增加（P＜0.01），肝指数升高（P＜0.05）；与模型组相比，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1组肝湿重、体重和肝指数均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+Met 100 mg·kg-1组肝湿重、体重和肝指数差异无统计学意义（表2）。

Tab.2 Effect of gastrodin（GSTD）on liver mass，body mass，liver indexes of nonalcoholic steatohepatitis（NASH）mice fed with a high fat and high cholesterol（HFHC）diet

2.2 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝组织结构、胶原增生和脂质沉积的影响

HE、Masson和油红O染色结果见图1，HE染色的NAS评分结果见图2，正常对照组肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周整齐排列，肝血窦可见少数枯否细胞浸润，肝细胞内有少量脂质沉积，无明显胶原增生。模型组小鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞质疏松，出现严重的大泡性脂肪变性，并伴有大量炎症细胞浸润，肝组织汇管区有大量增生的胶原纤维。模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1组HFHC所致的肝脂肪变性、炎症细胞浸润和胶原纤维增生均有所改善。HE染色结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝NAS评分明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1组小鼠肝NAS评分显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of GSTD on hepatic morphology，collagen deposition and lipid content of NASH mice fed with an HFHC diet by HE，Masson and Oil red O staining（×200）.See Tab.2 for the mouse treatment.Black arrows show liver pathological changes of the liver including inflammatory infiltration and steatosis，purple arrows show the fibrotic area，and blue arrows show the area of lipid deposiion.

Fig.2 Effect of GSTD on nonalcoholic fatty liver an disease activity score（NAS）of NASH mice fed with HFHC diet.See Tab.2 for the mouse treatment.NAS is the sum of the scores of three components：steatosis（0-3），lobular inflammation（0-3）and hepatocyte ballooning（0-2）.There are eight mice per group，with 15 images for each mouse.＊＊P＜0.01，compared with normal control group by Kruskal-Wallis H test；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group by Kruskal-Wallis H test.

2.3 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠血糖和血清胰岛素水平增加（P＜0.01），胰岛素抵抗指数升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1组小鼠血糖和血清胰岛素水平降低，胰岛素抵抗指数降低（P＜0.01）（表3）。

Tab.3 Effect of GSTD on blood glucose，an insulin and HOMA-lR in serum of NASH mice fed with HFHC diet

2.4 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠血清GPT和GOT活性的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠血清GPT和GOT活性明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+GSTD 12.5，25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1组血清GPT和GOT活性显著降低（P＜0.05，P＜0.01）（表4）。

Tab.4 Effect of GSTD on activities of glutamic pyruciv transaminase（GPT）and glutamic oxaloacetic transaminase（GOT）in serum of NASH mice fed with an HFHC diet

2.5 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝组织TG，TC和NEFA水平的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织TG，TC和NEFA水平升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1和模型+Met 100 mg·kg-1组肝组织TG和NEFA水平降低（P＜0.01）。同时，与模型组相比，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1组小鼠肝组织TC水平显著降低（P＜0.01），而模型+Met 100 mg·kg-1组TC水平无明显变化（表5）。

Tab.5 Effect of GSTD on levels of triglyceride（TG），cholesterol（TC）and nonestesterified fatty acid（NEFA）in liver tissue of NASH mice fed with an HFHC diet

2.6 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝组织MDA和GSH水平及CAT和SOD活性的影响

结果如表6所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织MDA水平升高（P＜0.01），SOD、CAT活力和GSH水平降低（P＜0.01）；与模型组小鼠比较，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1组肝组织MDA水平降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD、CAT 活性和GSH水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，模型+Met 100 mg·kg-1组SOD、CAT活性和GSH水平升高（P＜0.01，P＜0.05），而MDA水平与模型组比较无明显变化。

Tab.6 Effect of GSTD on levels of MDA，GSH，and activities of CAT and SOD in liver tissue of mice fed with an HFHC diet

2.7 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝脂质合成和氧化相关基因mRNA表达的影响

结果如表7所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织FASN，CD36，SCD1和PPARγmRNA水平升高（P＜0.01），PPAR α和CPT1αmRNA水平降低（P＜0.01）；与模型组小鼠比较，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1组肝组织FASN、CD36、SCD1 和PPARγmRNA水平明显降低（P＜0.01），PPARα和CPT1αmRNA水平升高（P＜0.01），模型+Met 100 mg·kg-1组肝组织CD36 mRNA水平明显降低（P＜0.01），CPT1αmRNA水平明显升高（P＜0.01）。

Tab.7 Effect of GSTD on levels of FASN，CD36，SCD1，PPAR γ，PPAR α and CPT1 α mRNA in liver tissues of NASH mice fed with an HFHC diet by RT-qPCR

2.8 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝组织炎症因子基因mRNA表达的影响

结果如表8所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织TNF- α，IL-6，IL-1β，CCL2和CCL5mRNA水平升高（P＜0.01）；与模型组小鼠比较，模型+GSTD25.0和50.0mg·kg-1以及模型+Met100mg·kg-1组肝组织TNF- α、IL-6、IL-1β、CCL2和CCL5mRNA水平均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.8 Effect of GSTD on levels of TNF- α，IL-1 β，IL-6，CCL2 and CCL5 mRNA in liver tissue of NASH mice fed with an HFHC diet by RT-qPCR

2.9 GSTD对HFHC诱导的NASH模型小鼠肝组织纤维化标志物基因mRNA表达的影响

结果如表9所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织ColⅠ α1，Actα2，CTGF和TGF- β1mRNA水平升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+GSTD25.0 和 50.0 mg·kg-1组肝组织ColⅠ α1，Actα2，CTGF和TGF- β1mRNA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；模型+Met 100 mg·kg-1组肝组织ColⅠ α1和TGF- β1mRNA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），而Actα2和CTGFmRNA水平与无明显变化。

Tab.9 Effect of GSTD on levels of ColⅠ α1，Act α2，CTGF and TGF- β1 mRNA in liver tissue of NASH mice fed with an HFHC diet by RT-qPCR

2.10 GSTD对HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝组织lRS-1，Akt和NF- κB蛋白磷酸化水平的影响

Western印迹结果如图3所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织中IRS-1和Akt磷酸化水平降低（P＜0.01），NF-κB的磷酸化水平明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1组小鼠肝组织中IRS-1和Akt磷酸化蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），NF-κB磷酸化蛋白表达水平降低（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of GSTD on phosphorylation levels of insulin receptor substrate 1（lRS-1），protein kinase B（Akt）and NF- κB in liver tissue of NASH mice fed with HFHC by Western blotting.See Tab.2 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 讨论

本研究发现，HFHC饮食诱导的NASH模型小鼠肝功能受损，肝组织内脂质（TG，TC和NEFA）沉积增加，脂质合成基因FASN，CD36，SCD1和PPAR γmRNA水平增加，脂质氧化基因PPAR α和CPT1 αmRNA水平下降。同时，肝组织内MDA含量升高，抗氧化系统中SOD和CAT活性及GSH水平降低，并伴有较高的炎症因子（TNF-α，IL-6，IL-1β，CCL2和CCL5）和纤维化标志物（ColⅠα1，Actα2，CTGF和TGF-β1）基因mRNA水平。与临床NASH患者表现出相似的病理特征。ig给予GSTD治疗后，肝功能受损、脂质代谢紊乱、肝内氧化应激、炎症反应和纤维化指标均明显逆转，表明GSTD对HFHC所致的NASH具有显著改善效果。

NAFLD的病因及发病机制具有多样性，IR和脂质代谢紊乱仍是目前该病发生的关键因素［10］。多项研究表明，脂质代谢主要受胰岛素信号通路调节，肝脂质积累与IR密切相关［11］。生理状态下，人体摄入的NEFA会被输送到肝，转化为TG并转运至脂肪组织。当机体出现IR时，随着NEFA的大量增多，导致肝细胞脂肪变性。IRS-1作为一种由胰岛素受体酪氨酸激酶磷酸化的蛋白质，负责胰岛素信号的转导。已在包括2型糖尿病和NAFLD代谢疾病中观察到，IR导致胰岛素敏感性降低，并伴随p-IRS-1水平降低［12-13］。IRS-1的激活对于胰岛素信号传导至关重要，这可能有利于减轻NAFLD。而Akt是胰岛素信号级联的另一个重要组成部分。胰岛素与胰岛素受体结合后，胰岛素受体酪氨酸位点被磷酸化，随后触发Akt激活［14］。IR伴随着NAFLD中Akt磷酸化的降低，维持适当的p-Akt水平可以改善肝脂肪变性［15］。因此，激活IRS-1/Akt信号是提高胰岛素敏感性和改善NAFLD的有效途径。本研究发现，GSTD能逆转HFHC造成的NASH小鼠肝脂肪样变，改善肝功能。进一步研究发现，GSTD能明显激活肝内IRS-1/Akt信号通路，可能是GSTD改善HFHC所致NASH的潜在部分机制。值得一提的是，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）是影响脂质积累关键因素，GSTD主要通过激活AMPKα来减弱肝脂质积累，但不影响白色脂肪组织中的脂质积累［16］。然而，AMPK强大而普遍的病理生理功能可能会引发某些不良副作用。NASH作为一种具有多种代谢并发症的疾病（如高血糖、高血脂和肥胖等），针对其病理环节的单一靶点药物治疗效果有限。本研究发现，GSTD的药理作用不局限于对脂质代凋紊乱的调节作用，其对NASH病变相关的高糖血症、肥胖和肝纤维化素均有显著缓释作用。因此，相比AMPK激动剂或降糖药来说，GSTD可能是一种很有前景的治疗NASH药物。

促氧化物与抗氧化物之间的动态失衡将导致氧化应激，氧化应激与随后产生的脂质过氧化和炎症反应则是促进NAFLD发展的重要因素［17］。当细胞内以还原型GSH和CAT等为主的抗氧化系统未能及时清除活性氧时，氧化还原失衡导致氧化应激。值得注意的是，脂质诱导反应性氧化物产生和内质网应激，然后通过NF-κB激酶抑制因子激酶途径促进肝细胞释放促炎细胞因子。随后，被激活募集的炎症细胞持续释放炎症细胞因子，进一步加剧肝炎症反应［18］。此外，在氧化应激的整个反应过程中，免疫系统的反应也会增强，增加ColⅠ沉积，促使纤维化的发生［19］。本研究发现，GSTD能明显缓解NASH小鼠肝内氧化应激，抑制肝纤维化的发展，抑制NF-κB蛋白磷酸化，减轻炎症反应，这可能是GSTD改善NASH的另一种机制。

综上，GSTD对HFHC饮食诱导的小鼠NASH具有明显改善效果，其作用机制可能与激活肝内IRS-1/Akt信号转导通路、缓解氧化应激和抑制NF-κB信号介导的炎症反应有关。