不同轮作模式下高发小麦赤霉病土壤真菌多样性变化

路 妍，高 健，康文钦，袁喜丽，景 岚

(1.内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010011；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.乌拉特中旗农牧业技术推广中心，内蒙古 乌拉特中旗 015300)

小麦赤霉病又称烂穗病，是由禾谷镰孢菌复合种(Fusariumgraminearumcomplex)侵染引起的灾害性病害[1]，世界各地均有发生，温暖湿润地区发生尤为严重[2]。该病害在我国主要发生在南方冬麦区，如长江中下游、川滇冬麦区和华南冬麦区等地，经常流行成灾，已成为小麦主产区威胁最大的流行性病害[2]。东北春麦区由于雨热同季，也发生严重，2010年以来病害呈现向北方扩展的趋势[3]。2019年，黑龙江省6，7月降雨偏多，造成赤霉病偏重流行。

赤霉病不仅直接造成减产，同时由于病粒含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素，人、畜误食病粒后会引起发热、呕吐、腹泻流产、死胎等中毒反应，还有致癌、致畸和诱变的作用，严重的甚至导致死亡[4]。因此，我国规定小麦及其产品中DON和ZEN含量不得超过1 mg/kg和60 μg/kg。近年来，毒素污染问题时有发生，赤霉病高发地区毒素超标问题较为严重[5]。

在东北春麦区小麦赤霉病主要以菌丝、子囊壳在病株和麦壳上越冬，是第2年的主要初侵染源。秸秆还田导致田间赤霉病菌菌源量显著增加，根际土壤生态环境恶化[6]。土壤微生物是土传病害发生的引擎。农田土壤微生物群落结构主要受耕作方式和管理模式的影响。作物轮作模式下，由于多种作物组合，土壤微生物群落结构较单一作物模式发生变化，影响了土壤的生态功能[7]。目前，已有关于适宜作物通过与病原菌非寄主植物的轮作而显著降低土壤中的病原菌数量的报道。王保通等[8]研究发现，油菜和小麦轮作降低了小麦全蚀病(Gaeumannomycesgraminis)的发病率。张丽红等[9]报道，利用菊花—生菜—辣椒轮作增加了根围芽孢杆菌数量，可使真菌数量降低。Cobo-Díaz等[10]研究发现，高适应性的拮抗微生物组合，对赤霉病防控有积极作用。加拿大、埃及和美国学者揭示了非洲传统作物禾参的根围细菌通过释放杀菌物质阻断赤霉菌对小麦根部的侵染[11]。于高波等[12]研究发现，小麦、毛苕子与黄瓜轮作有利于缓解黄瓜连作障碍，改善土壤微生态环境，提高黄瓜产量。

本研究利用ITS2扩增子测序技术，对东北春麦区几种作物轮作种植模式下，土壤微生物群落组成、多样性及小麦赤霉菌(Gibberellazeae)含量等特征进行了系统分析，以期揭示不同种植模式下土壤微生物类群特征以及对小麦赤霉菌含量的影响，为适宜的轮作系统推广提供一定的理论指导。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于额尔古纳市拉布大林农场(50°14′ N，120°08′ E)。该地区属于大陆性亚寒带气候区，春季干旱多风，夏季温凉短促、降雨相对集中，秋季降温急剧，冬季寒冷漫长，年平均气温-5～-1 ℃，昼夜温差大，雨热同季。土质肥沃，自然肥力高，耕地集中连片。主要作物有春小麦、油菜、马铃薯、玉米、莜麦等。

1.2 试验设计

试验共设置5个处理：小麦-小麦-马铃薯轮作(T)、小麦-小麦-水飞蓟轮作(MT)、小麦-小麦-油菜轮作(R)、小麦-小麦-甜菜轮作(S)、小麦-小麦-小麦连作(W)，以小麦连作3 a为对照。5个处理的试验地在2018，2019年连续种植小麦，2020年5月2日播种各处理，每个小区试验面积为6.67 hm2，不同处理的土壤肥力及管理方式相同，全程机械化种植，联合收获秸秆直接还田。

1.3 土壤样品采集

2020年秋于作物收获后采集土壤样品，将小麦、马铃薯、油菜、甜菜和水飞蓟整株拔出，除去根系周围大块土，收集根系周围土壤样品。每个小区5点取样，共采集 25份土壤样品，-80 ℃ 冰箱保存，用于DNA提取。

1.4 土壤微生物总DNA的提取和测序

1.4.1 土壤微生物总DNA提取 采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒(OMEGA)的方法进行样本基因组DNA提取，并利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA进行精确定量。

1.4.2 目标片段PCR扩增及测序 引物设计以ITS2区的序列为靶目标，引物序列为：fITS7(5′-GTGARTCA

TCGAATCTTTG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA

TGC-3′)。PCR总反应体系为42.5 μL(Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL、Forward Primer 2.5 μL、Reverse Primer 2.5 μL、DNA模板50 ng、H2O 25 μL)；PCR反应条件：98 ℃，30 s； 98 ℃，10 s；54 ℃，30 s；72 ℃，45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃，∞。PCR扩增产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目标片段，回收使用回收试剂盒(AMPure XT beads)。对纯化后的PCR产物经Oubit对文库进行定量。文库检测合格后，使用MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序，应用试剂为MiSeq Reagent Kit V3。

1.5 数据处理

采用Cutadapt[13]先对reads进行低质量部分剪切，截去Barcode和引物序列，采用FLASH[14](Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.8，FALSH) 将每一对paired-end reads拼接合并成一条更长的tag，对测序reads进行窗口法质量扫描，扫描窗口默认为100 bp，当窗口内平均质量值低于20时，将read从窗口起始到3′终止的部分截掉，去除截短后长度小于100 bp的序列，去除截短后N(不确定模糊碱基)的含量在5%以上的序列，初步质控得到原始数据。然后采用Vsearch[15](v2.3.4，Vsearch)软件将嵌合体序列过滤，最后进行Q20、Q30等质控分析，获得最终clean data。

采用Vsearch算法，将序列相似性大于97%的clean tags定为1个OTU，挑选OTU的代表序列，采用QIIME[16]等软件，利用UPARSE算法对unique序列在大于97%相似性条件下进行聚类，获得OTU代表序列及其对应的丰度[17]。同时采用RDP 11.5和Unite数据库(Ver.7.2，2017.06.28更新)对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学注释分析，获得不同分类水平(界门纲目科属种)下5种种植模式的土壤中真菌物种丰度及微生物优势菌群。之后利用QIIME和R软件vegan包等对样本进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析。最后对25份土壤样本在不同分类水平的具体物种组成进行分析，从而找到小麦赤霉菌在不同土壤样本中的含量。

2 结果与分析

2.1 不同轮作模式下土壤真菌测序结果及OTU统计分析

通过Illumina MiSeq测序平台共获得911 229条有效序列，81.50%的序列片段大小为200～300 bp，18.17%为300～400 bp。经97%的相似性聚类统计后共获得1 586个OTUs，OTUs分布的韦恩图表明，5个处理共有的OTUs数目为278个，占OTUs总数的17.53%。连作处理(W)特有的真菌OTU数目最多，为98个，占其总OTUs(389个)数目的25.19%。轮作马铃薯(T)、水飞蓟(MT)、油菜(R)和甜菜(S)处理特有的真菌OTU占其各自总OTUs的比例分别为19.34%，14.35%，19.32%和10.73%(图1)。

2.2 Alpha多样性分析

通过稀释曲线可以看到，所有曲线均趋于平缓，样品的测序深度已到平台期，证明测序数据量已饱和，可以覆盖样品中绝大部分真菌类群(图2)。

选取4个常用的alpha多样性指数进行分析，即Chao1、Shannon-wiener、Simpson和Good coverage(表1)。其中，Chao1指数可用来估计物种的数目，Chao1指数高，说明样品物种数目多，群落的丰富度高。由表1可知，与W处理相比，R和S处理Chao1指数分别增加了11.08%，8.59%，且差异显著(P<0.05)；MT和T处理Chao1指数减少了4.45%，7.44%；Chao1指数最高的R处理其OTU数目也最多，与之相比，2个指数值最低的处理T，其OTU数目也最少。Shannon和Simpson可以反映出对应群落的多样性，Shannon 指数越大、Simpson 指数越趋近于1，则表示该处理下的样品的物种多样性越高。MT处理的Shannon指数高于W处理，R和T处理的Shannon指数略低于W处理，但差异不显著(P>0.05)，S处理低于W处理，且差异显著(P<0.05)。3种轮作处理R、MT、T的Simpson指数都高于W处理，且接近于1。S处理与W处理数值相等，差异不显著(P>0.05)。上述结果表明，与连作处理W相比，轮作处理R和S增加了土壤真菌的丰富度，MT处理提高了土壤真菌群落的多样性，且差异显著(P<0.05)。

2.3 Beta多样性分析

Beta多样性是指不同环境群落之间的物种差异性，本试验通过主坐标分析(Principal coordinates analysis，PCoA)和UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)聚类分析对5个处理25份土壤样本进行聚类分析，结果如图3所示。由图3-A可知，每个处理的5个重复都聚到一起，处理T与处理W距离较远，处理间差异较大。由图3-B可知，T处理和W处理的分支距离最远，处理间真菌群落组成差异较大。

A.主坐标分析(PCoA)；B.Unweighted unifrac聚类树分析。A.Principal coordinate analysis(PCoA)of unweighted Unifrac distances；B.UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)cluster analysis based on unweighted Unifrac distances.

2.4 不同轮作模式对土壤真菌群落结构的影响

2.4.1 不同轮作模式下土壤真菌门水平群落结构 在门水平，除少数真菌未被分类外，5种模式的土样主要分布在8个优势真菌门类(图4)：子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、未知菌门(Fungi unclassified)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、虫霉门(Entomophthoromycota)。其中，子囊菌门为各模式的优势菌群，相对丰度为65.15%～85.29%；其次相对丰度较高的为接合菌门(4.72%～22.48%)和担子菌门(4.48%～8.45%)真菌。连作(W)较各轮作模式接合菌门、未分类的真菌丰度增加，子囊菌门和担子菌门真菌丰度降低。

图4 不同轮作模式土壤中门分类水平的真菌组成Fig.4 Fungal community composition in soil samples at the phylum level under different rotation patterns

2.4.2 不同轮作模式下土壤真菌属水平群落结构 在属水平上，5种处理的土样共鉴定出275个真菌属，W，R，S，MT，T分别为202，206，195，164，167个属。图5为各模式中丰度前20的真菌属。其中共有的优势属有被孢霉属(Mortierella)(4.68%～22.17%)、赤霉属(Gibberella)(2.5%～4.9%)、柄孢壳菌属(Podospora)(2.15%～8.01%)和镰孢属(Fusarium)(1.36%～3.14%)；被孢霉属和镰孢属在连作(W)中丰度最高，赤霉菌属在T中丰度最高(4.9%)，在S中丰度最低(2.5%)；R中漆斑菌属(Myrothecium)丰度明显高于其他处理，T中织球壳属(Plectosphaerella)、柄孢壳属和小壶菌属(Spizellomyces)的丰度较其他模式高，S中四枝孢属(Tetracladium)、假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)、链格孢属(Alternaria)、小戴卫霉属(Davidiella)和隐球菌属(Cryptococcus)的丰度明显高于其他模式。MT中光黑壳属(Preussia)和毛壳属(Chaetomium)的丰度明显高于其他模式。

图5 不同轮作模式土壤中属分类水平的真菌组成Fig.5 Fungal community composition in soil samples at the genus level under different rotation patterns

2.4.3 不同轮作模式下土壤真菌优势种分布 在种的分类水平上，5种种植模式土壤中共鉴定出438个真菌种，W、MT、T、S和R分别有278，282，269，278，309个。图6为在各模式中相对丰度前10的真菌种，其中共有优势种为Tetracladiummaxilliforme(1.07%～16.33%)、交链格孢(Alternariaalternata)(0.24%～10.59%)、长孢被孢霉(Mortierellaelongata)(0.69%～11.97%)、Podosporatetraspora(1.79%～6.27%)、小不整球壳菌(Plectosphaerellacucumerina)(0.46%～3.97%)。其中长孢被孢霉主要分布在W中，Tetracladiummaxilliforme和交链格孢在S中丰度较高，Podosporatetraspora在T中丰度较高，小不整球壳菌在S、T、MT和R中丰度均在3.00%以上，在W中丰度相对较低(0.46%)；Plectosphaerellaplurivora在T中丰度最高，S中也有分布，其他模式中没有分布。

图6 不同轮作模式土壤真菌优势种分布Fig.6 The dominant species distribution of fungi under different rotation patterns

2.5 不同轮作模式下土壤真菌特异性

各种种植模式土壤均含有其特异的真菌OTU种类。与连作(W)相比，各轮作模式S、MT、T和R独有的真菌OTU数目均有减少(图1)。说明不同的轮作模式能引起土壤真菌菌群特异性变化，但特异的物种因轮作模式不同而有差异。其中W模式土壤中特异菌有厚垣轮枝孢菌(Metacordyceps)、多孢囊霉属(Diversispora)、珊瑚菌属(Clavaria)、拟青霉属(Paecilomyces)、Conlarium、Cristinia和Remersonia；S模式特异菌有壳针孢属(Septoria)、小丛壳属(Glomerella)、Amaurodon、维罗纳霉属(Veronaea)和叉丝单囊壳属(Podosphaera)；MT模式土壤中特异菌有壳多胞菌属(Stagonospora)、双型囊霉属(Ambispora)、枹蕈属(Peniophora)、Calcarisporiella和Monosporascus；T模式特异菌有粉褶菌属(Entoloma)、Basidioascus、布尔喀霉属(Burgoa)、Volvopluteus和光柄菇属(Pluteus)；R模式特异菌有Toxicocladosporium、地星属(Geastrum)、Paurocotylis、Mastigobasidium和伞菌属(Bolbitius)。

2.6 不同轮作模式下土壤中小麦赤霉菌相对丰度

本试验检测了引起小麦赤霉病的病原菌(Gibberellazeae)在土壤中的含量，结果显示，该病原菌的分布在5种种植模式间存在差异，其中T模式中丰度最高(0.66%)，与其他模式相比差异显著(P<0.05)；W模式次之(0.06%)；在S模式中为0.05%；在MT和R模式中丰度很低，分别为0.03%和0.01%(图7)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different letters meant significant difference at 0.05 level.

2.7 不同轮作模式下土壤真菌群落结构相似性聚类分析

对5种不同种植模式土壤真菌群落结构相似性进行聚类分析，结果显示，真菌群落分为3组(图8)。W单独成为一组，T与MT模式真菌群落聚集在组1中，S与R模式聚集在组2中。表明，T与MT模式以及S与R模式的群落结构相似性更高。

图8 不同轮作模式土壤真菌群落结构相似性聚类分析Fig.8 Cluster analysis of soil fungal community structure under different rotation patterns.

3 结论与讨论

土壤真菌是土壤微生物的主要组成部分，在土壤物质的分解、养分循环与能量流动过程中扮演重要的角色[18-20]，土壤中除了有益真菌，还有一部分是侵染作物、引起作物病害的有害真菌。土壤中真菌群落结构的多样性影响作物的健康生长，通过耕作模式的改变，能够改善土壤中微生物群落多样性。其中轮作是一种重要的耕作模式。轮作可以增加作物多样性、提高土壤生产力，而且可以改善土壤环境使病原真菌失去适宜的寄生条件，从而防止病原真菌滋生蔓延[21-22]。但不同的轮作模式对土壤真菌群落组成的影响不同。

研究不同植物与小麦轮作模式下土壤真菌群落组成、多样性及特异真菌的分布特征，可进一步了解有益或致病真菌与植物宿主的关系[23]。从真菌群落组成和功能角度阐释不同作物的轮作模式抑制小麦赤霉病或隔断病害传播的微生物学机理，从而为筛选较为合理的轮作模式提供理论依据。

3.1 不同轮作模式土壤真菌多样性特征

土壤真菌群落与土壤环境之间的相互关系可以用多样性指数反映，不同的作物轮作模式对土壤环境产生的影响不同，菌群丰富度和多样性也存在差异[24-25]。有研究表明，土壤养分含量与微生物数量之间存在正相关关系，微生物具有较高分解腐殖质能力，促使土壤物质更好地循环，土壤养分高，微生物多样性也就高[26]。本研究中，MT模式提高了土壤真菌群落的多样性，R模式土壤真菌群落的丰富度最高，轮作模式S土壤真菌的丰富度与连作相比也有提高。有研究表明，油菜等十字花科植物的根系可以分泌有助溶解和转化土壤中难溶性磷的有机酸，提高土壤速效磷含量，促进微生物的代谢活动，增加微生物数量和提高群落微生物多样性[27]。

3.2 不同轮作模式土壤真菌类群组成

合理轮作不仅能丰富有益真菌的种类、减少土壤里有害真菌的数量，而且还能改变土壤中微生物群落结构[28]。土壤微生物在抑制土传病害和诱导植物抗性中起着重要的作用[29]。本研究中，各模式土壤共同的优势菌门为子囊菌门、接合菌门、担子菌门、壶菌门、球囊菌门、油壶菌门和虫霉门，但各菌门的丰度大小在不同模式间存在差异。本研究中，子囊菌门为5种模式共有的优势菌群，相对丰度在65.15%～85.29%，这一结果与前人研究结果一致[30-32]。有研究表明，子囊菌门是土壤中主要的分解者，能够分解环境中的木质素和角质素等难降解的有机质[33-35]。子囊菌在各优势属中仍然占主导，其中柄孢壳属、织球壳属、假裸囊菌属和毛壳属在5种模式中均为优势属，但丰度大小不同。接合菌门在各处理中的丰度仅次于子囊菌门，其中贡献最大的是被孢霉属，丰度为4.68%～22.17%。研究发现，长孢被孢霉可以防止土壤退化，改善土壤，并促进植物生长素的产生[36]。另外，4种轮作模式较连作土壤中担子菌门真菌丰度增加。研究发现，有些担子菌可与植物形成菌根，有利于作物生长。

病害发生的原因主要是某一类病原菌在土壤微生物群落中成为优势菌群，增加了植物的发病概率。水飞蓟、甜菜、油菜与小麦轮作的土壤中小麦赤霉菌较小麦连作土壤丰度降低，说明适宜的轮作模式可以降低小麦赤霉病菌群的富集。作物通过不同轮作方式，能使病原微生物失去原寄主，从而减轻病害的发生。作物连作增加了病原菌的富集。然而不同的轮作作物产生的效应不同。本研究中，小麦与马铃薯轮作模式，小麦赤霉病菌显著增加，这与田间对赤霉病的发病情况调查结果一致。而且OTU值也是几种种植模式中最低的，反映出该轮作模式容易使优势病原菌积累，而且微生物多样性不仅没有增加反而较连作有所降低。

3.3 不同轮作模式土壤真菌特异性

微生物与植物之间互相选择，互相影响。不同作物的土壤中有着各自特异的微生物种群[37]。研究发现，土壤中微生物菌群内特异种群数量越多，土壤生态环境越不稳定[38]。本研究中，W处理中特异菌分布最多，表明其土壤条件稳定性最差；W模式中特异菌有Remersonia、Conlarium和拟青霉属等。研究发现Remersonia在高发镰刀菌枯萎病(Fusdrzumoxysporum)土壤的微生物群落中具有重要作用[39]。Conlarium是深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes，DSE)，DSE具有类似菌根的生态学功能。有研究发现DSE类群中的一些种对枯萎病具优良生防作用[40]。在4种轮作模式中，发现均存在一些特异的有益真菌。MT模式土壤中特异菌双型囊霉属是一种丛枝菌根真菌。王启[41]在研究草原百合科植物菌根真菌时发现双型囊霉属真菌可在葱属植物根系内共生；另外，还有枹蕈属，可产生植酸酶。有研究发现一些枹蕈属产生的植酸酶对土壤中添加的六磷酸肌醇和内源有机磷有很好的水解效果[42]。R模式发现的一种特异菌Paurocotylis是一种丛枝菌根真菌。

3.4 土壤真菌群落结构相似性分析

土壤真菌群落结构受地上种植作物的影响，群落相似性聚类分析结果表明，S与R，T与MT土壤真菌群落结构相似，W模式与各轮作模式差异较大。小麦—小麦—甜菜、小麦—小麦—油菜轮作中，轮作作物种植周期、土壤耕作方式相同、对土壤资源的利用方式相似，对真菌群落结构的改变作用相同。小麦—小麦—马铃薯、小麦—小麦—水飞蓟轮作中，轮作作物对土壤性质、生态特性要求一致，所以土壤菌群结构较相似。小麦连作与其他轮作作物相比对土壤资源的利用方式、对土壤性质要求不同，因此真菌群落结构差异较大。

本研究详细分析了油菜、马铃薯、甜菜和水飞蓟与小麦轮作及小麦连作模式中真菌群落的丰富度、多样性和组成的变化，以及小麦赤霉菌丰度的变化。油菜和甜菜与小麦轮作增加了土壤真菌的丰富度，水飞蓟与小麦轮作提高了土壤真菌群落的多样性。油菜、甜菜和水飞蓟与小麦轮作模式中，小麦赤霉菌的相对丰度均有所下降，另外其他有益菌群明显富集，例如Ambispora、Peniophora和Paurocotylis等。近年来，额尔古纳市不断优化农业种植结构，持续提高经济作物种植面积，主要种植小麦和油菜，大力发展水飞蓟、甜菜和莜麦等特色产业。因此，根据本研究结果建议选择油菜、水飞蓟和甜菜作为与小麦轮作作物，以减轻小麦赤霉病的危害。