基于舌苔微生态研究愈疡汤对干预复发性口腔溃疡的机制*

时小红 文乾钧 彭茜茜

1 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

2 杭州市第一人民医院 浙江 杭州 310003

3 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer，ROU）是一种以口腔黏膜炎性反应或增生为病理特征的口腔疾病。菌群紊乱诱发ROU的病理机制已成为近5年新的研究方向。本研究以舌苔微生态菌群为对象阐述菌群参与ROU的病变机理，有望阐明ROU的发病新机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象：40例受试者中，20例ROU确诊者为杭州市第一人民医院2017年9月至2018年12月纳入的患者，20例健康者为浙江中医药大学学生。20例ROU患者符合入组标准，男性10人，女性10人，1人用药前后标本采集结束后一般资料缺失；平均年龄35.4岁；入组初期行症状分级量化、症状自评量表SCL-90[1]心理健康测试调查问卷测评。本研究得到杭州市第一人民医院医学伦理委员会审批。受试者签署知情同意书，ROU症状分级量化评分、心身症状自评量表积分等参考《中药新药临床研究指导原则》和相关文献。

1.2 诊断标准：西医诊断标准参照3版《口腔内科学》教材和《实用口腔学》，复发性口疮诊断标准和分型标准：①轻型口疮：溃疡小而浅，数目少，1～3个，1～2mm大小，红肿不著，边缘整齐有红晕，基底稍凹平坦，一般7～10天愈合，愈合不留疤痕。②口炎性口疮：又称疱疹性口疮，溃疡表浅平坦形状不规则，可由小米粒大小到蚕豆大小，数目多可达数十个，可互相融合，有黄色渗出，周围充血明显，范围大，疼痛明显。③腺周口疮：又称巨型口疮，溃疡大而深，成弹坑状，溃疡面积可达1cm以上，常孤立发生，亦可同时发生数个，边缘高起明显，充血不著或显黯红，病程长，愈合缓慢，可达1个月至数月，愈合后留有疤痕。

1.3 纳入标准：①符合西医诊断标准。②根据各期临床试验目的以及本病特点，确定合理的纳入病程。③注意合理的受试年龄。④签署进入研究知情同意书。

1.4 排除标准：①不符合中医或西医复发性口疮诊断的非复发性口疮，如创伤性溃疡、癌性溃疡、感染性口炎、白塞病及其他溃疡者。②意向妊娠或孕妇、哺乳期妇女。③过敏体质和对多种药物过敏者。④合并心血管、脑血管、肝肾系统和造血系统等严重疾病或精神病患者。

1.5 复方中药干预方法：根据ROU诊治方案，给予ROU组自拟方愈疡汤（金银花20g、人中白10g、木芙蓉15g等）为基础方干预。本研究所用药物均为饮片制剂（江阴天江药业生产），按照《中华人民共和国药典》2015版规定范围内剂量执行制定处方；水煎服，2次/日，临床干预7天。治疗1周，收集舌苔样本备用。3个月、6个月时随访。

1.6 样本采集：共收集舌苔样本60例，其中ROU组治疗前采样20例、治疗后采样20例，健康对照组采样20例。舌苔样本采集方法：使用拭子刮取，样本从舌背中部开始，从后向前刮3次，刮取舌中心1cm2的部位，约5s。立即在含有750μL的MoBio buffer中涡旋。拭子上的海绵应该在离心管壁多按压几次，约20s，以确保将细菌转移到buffer中。然后将buffer在-80℃冷冻保存，直到开始实验。

1.7 实验流程：具体如下。

1.7.1 基因组DNA和RNA抽提：使用TriZol方法同时提取样本RNA和DNA。

1.7.2 宏基因组测序及分析方法：使用Illumina MiSsq 16S rRNA测序试剂盒，测序16S RNA V3-V4区间550bp序列，并得到样本宏基因组文库。

1.7.3 RNA测序：对ROU组、健康对照组的RNA进行测序，并使用DEGUST筛选出显著改变表达的基因。

1.7.4 统计学处理：采用描述性方法进行统计分析。

2 结果

基于门属水平的各组测试者舌苔微生物构成的研究结果，具体如下。

2.1 物种构成：根据物种注释结果，统计每个样品在界（kingdom）、门(phylum)、纲(class)、目 (order)、科(family)、属(genus)、种(species)水平上的序列数目，由此可以了解各分类水平整体注释情况。样品中生物多样性信息，经比对后获得分类操作单元（OTU）为171。各样品在细菌各分类水平上具较大差异，提示口腔溃疡患者与健康测试者之间以及使用愈疡汤干预与否等因素可导致肠道菌群产生显著变化。

2.2 物种分类：本研究采用同源性序列比对聚类等方法，将所有的序列鉴定为8个门。厚壁菌门，研究发现肥胖与两种主要的细菌（拟杆菌门和厚壁菌门）丰度相关；肥胖菌群具有增加从食物中获得能量的能力[2]。变形菌门，有研究发现上千个随个体显著、持续变化的基因，这些可变基因和变形菌门有关[3]。梭杆菌门，可作为潜在的标志物用于ROU诊断和预后评估，也是治疗ROU的潜在靶点。放线菌门，可产生维生素、抗生素，复方中药通过调节此类菌群而实现免疫功能的提升并成为复方中药重要作用机制。螺旋菌包括幽门螺杆菌在内的弯曲菌和螺旋菌。典型致病菌为幽门螺杆菌，通过酸碱平衡失调，酸增多腐蚀正常组织，导致溃疡经久不愈，甚至细胞异生，癌变。

2.3 复发性口腔溃疡患者的舌苔菌群变化：ROU组治疗前与健康对照组比较，28个OTU水平下降，43个OUT水平升高，并具有统计学差异（P＜0.05）。ROU组治疗后与健康对照组比较，31个OTU水平升高，140个OUT下降，并具统计学差异（P＜0.05）。ROU组治疗前后比较，治疗后3个OTU水平升高，2个OUT水平下降，并具有统计学差异（P＜0.05）。

3 讨论

在应激、焦虑、抑郁时症状易复发是笔者前期临床研究结果的一部分[4]。多项研究证实，口腔疾病患者舌苔微生态菌群结构与健康人存在差异。如李伟等［5］发现萎缩性舌炎患者舌苔中致病菌菌落数量明显增多。由于舌自洁能力的减弱，引起舌苔微生物的异常变化，加重了患者本身的感染。朱振亚[6]证实复发性口腔溃疡与患者口腔微生物菌群变化有显著相关性。有研究者在ROU患者的病损部位分离并培养出了L型链球菌，且发现其繁殖周期与口腔溃疡的复发周期相一致，说明口腔常见菌群（链球菌、韦荣菌）的变化与ROU的发病可能存在一定的相关性[7]。

目前认为单味或复方中药对于微生态菌群的干预，可能通过改变菌群的组成，改善菌群失调等来实现。菌群可能将草药中的化学成分转化为有不同生物活性/毒性及不同生物利用度的代谢产物[8]。中药的作用靶点有可能是肠道菌群，通过多药配伍组合促进肠道微生态等共生菌从病理状态向生理状态切换，从而表现出良好的慢病治疗效果[9-11]。

纵向上，舌苔类群之间的相关性可能表明舌苔细菌之间的协同或拮抗作用。健康个体仍然拥有支持疾病相关细菌的生态组成。与病原微生物相容的健康转移是由于病原菌的比例增加，而不是由于先前健康个体中的疾病相关细菌的重新定植。通过有效地减少舌苔和周围环境中病原体的相对丰度来降低感染的概率，有效地控制舌苔中病原体的相对丰度，对于治疗后的患者来说更为重要[12]。