发光细菌法在煤化工废污水急性毒性评价中的应用

宋张杨，韦 昊，魏 玥，孙晓懿，孙照东，焦瑞峰

（黄河水资源保护科学研究院，河南郑州 450004）

工业废水污染物种类繁多且成分复杂，不可避免存在无法处理或未降解完全的有毒成分，威胁环境和公共健康以及对污水处理厂的活性污泥体系造成致命冲击〔1-2〕。常规监测指标测定污水中的无机污染物和有机污染物指标，不能反映污水排入水体后的综合毒性效应，而生物毒性测试可以更直接表征污水的安全性〔3〕。2015 年11 月环境保护部办公厅修订的《城镇污水处理厂污染物排放标准》（征求意见稿）中也将综合毒性（稀释倍数）列入城镇污水处理厂污染物排放标准的选择控制项目。

发光细菌法是基于一种海洋发光细菌费氏弧菌Vibrio fischeri的发光活性，利用灵敏的光电检测系统测定废污水中的毒性物质对发光细菌发光强度的影响，判断毒性物质的毒性大小。因其监测步骤简单，获得结果快速而在污水、土壤、污泥、垃圾渗滤液、海洋水产品等综合毒性评价中广泛应用〔4-8〕。

本试验以某煤化工企业污水处理厂进出水为研究对象，采用发光细菌法对其进水和出水进行毒性测定，为化工企业污水处理厂污水达标排放提供合理的评价和预警依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品和试验条件

试验样品取自某煤化工企业污水处理厂的进水口和出水口。测试细菌：海洋发光细菌费氏弧菌（Vibrio fischeri）。所有试验操作按照ISO 11348—32007 年第二版《水质—水样对费式弧菌发光抑制影响的测定第3 部分：使用冻干细菌法》所规定的试验条件和试验方法进行〔9〕。

1.2 样品采集

用棕色样品收集瓶采集样品。采集水样后瓶内应充满水样，不留空气，并用封口膜密封好，瓶外用铝箔纸包好，避光保存。毒性测定应在采样后6 h 内进行，否则需要2～5 ℃下避光保存待测样品，不超过48 h。

1.3 样品预处理

对于有固体悬浮物的样品，须静置0.5～1 h 或离心或过滤去除，以免干扰测定。

调节pH（手持pH 计测定），所有的样品需要测量pH，样品pH 需要处于6.0～8.5 之间。如需调节pH，使用盐酸或氢氧化钠溶液进行调节。盐酸或氢氧化钠溶液的加入量不能超过总体积的5%（必要时可使用高浓度的溶液来减少加入体积）。

调节盐分（电导率仪测定），根据所测盐分值添加NaCl到样品中，使样品的含盐质量浓度达到20 g∕L NaCl 等值渗透性。对于含盐量低的样品，直接添加NaCl 将其渗透性达到20 g∕L NaCl。如样品中含有20～50 g∕L NaCl 等值物，则不需要加入盐，但最终含盐量不能超过20 g∕L NaCl 的渗透性。

1.4 试剂和仪器设备

费式弧菌（Vibrio fischeri）菌种冻干粉：购自中宜仪器水质毒性筛查试剂盒（发光细菌）ZYI TOX-kitⅣ。储存于-20 ℃。

样品稀释液：质量浓度为20 g∕L 的NaCl 溶液，4 ℃保存。亦可作阴性质控液。

阳性参照液：试剂盒配备的ZnSO4溶液质量浓度为1 000 mg∕L，Zn2+质量浓度相当于227.36 mg∕L，细菌50%发光抑制的Zn2+质量浓度为2.0 mg∕L。测试中阳性质控液的配制为4.4 μL ZnSO4母液加入495.6 μL 样品稀释液混匀。

其他设备：冰箱，用于储藏菌种和试剂；金属浴温度调节模块（M500），维持测试样品在（15±1）℃；Microtox Model 500 毒性测定仪；试管（圆形比色皿），生物发光检测仪配套的试管，与金属浴温度调节模块相适合；pH计；计时器；移液器，10μL、100 μL、1 000 μL、5 mL；移液器配套的枪头；试管架；容量瓶；棕色样品收集瓶。

1.5 发光细菌急性毒性测定实验

费式弧菌（Vibrio fischeri）急性毒性测定实验按照以下步骤进行。

储备菌体悬浮液的制备：提前在4 ℃冷却1 mL 菌体复活液（来自试剂盒附带）。从-20 ℃取出细菌冻干粉，将提前预冷的1 mL 菌体复活液迅速倒入冻干细菌，轻轻晃动细菌冻干粉使其快速溶解。复苏的发光细菌悬浮液作为储备悬浮液用于检测，储存在4 ℃。

测试悬浮液的制备（参照Deltatox®user’s manual〔10〕中45% B-TOX 毒性测试方法）：待储备菌体悬浮液混合均匀（10 min 以上），吸取10 μL 储备悬浮液，500 μL 的细菌复苏液和渗透压调节液中，然后放入15 ℃的金属浴温度调节模块中，平衡5 min 以上，用于后续测定。大批次连续试验时，可将储备菌体悬浮液按照相同菌体浓度于100 mL 三角瓶中稀释定容，4 ℃储存备用。

测试温度：测定温度需要保持在（15±0.3）℃。所有的器皿和溶液测定前1 h 都需要保持在控温测试室内。

测试样品稀释系列：样品的稀释系列见表1，每个测试组别设2 个平行样。

表1 样品稀释系列Table 1 Sample dilution series

检测步骤：Microtox Model 500 毒性测定仪预热15 min，开始测定经过平衡的测试悬浮液的初始发光强度（I0），迅速加入1 000 μL 处理好的样品和质控液，摇匀测定完的试管继续放回15 ℃的加热模块中保温。分别测定反应时间为15 min（I15）和30 min（I30）的样品发光强度，记录所有数据。

1.6 数据处理和分析

以15 min 测试结果为例，30 min 的测试结果以相同方式表示。

阴性质控组：I0为细菌的初始发光值，Ik15为细菌与稀释液反应15min后发光值，Ik15∕I0为校正系数，为校正系数的平均值，有效性检验为均值与Ik15∕I0的算术差除以均值来计算，平均偏差不超过3%，检测有效。

阳性质控组和样品测试组：I0为细菌的初始发光值，I15为细菌与稀释液反应15 min 后发光值，为H15的均值。

EC20和EC50的计算：由已测定的样品污水所占比 例ct和Γt值，根据公式lgct=b·lgΓt+lga〔9〕，可 得 出EC20和EC50，当Γt=0.25 时对应EC20时样品污水所占比例，当Γt=1.00 时对应EC50时样品污水所占比例。

2 结果与讨论

表2 阴性质控实验（1～4 号）和阳性质控实验（5 号）结果Table 2 The results of negative control batch（No.1 to No.4）and positive control batch（No.5）

某煤化工企业污水处理厂进水和出水的检测结果见表3。

由表3 可知，1 号和2 号样品在15 min 和30 min的测试结果趋于一致，菌群发光率损失较为稳定，进水毒性都较强，EC20-15分别为9.83% 和10.86%，EC50-15分别为19.20%和16.03%，EC20-30分 别 为7.76% 和10.86%，EC50-30分 别 为15.05% 和14.20%。1 号和2 号进水样品在经过16 倍以上的稀释后基本达到无毒。3 号和4 号出水样品在4 倍稀释后抑制率H15和H30均呈负值，即细菌发光量出现增长现象。

R.GUERRA〔11〕在 研 究工业废水中 发 现COD 和Microtox®细菌毒性之间存在显著的负相关。而C.V.ARAÚJO 等〔1〕研究发现，工业污水进水COD 和细菌毒性的实验结果之间没有明显的相关性，而出水COD 和细菌毒性实验结果有着很好的相关性。R.BOLUDA 等〔2〕在研究中发现，即样品的成分越复杂，COD 与高毒性之间相关性越差。杨尚源等〔12〕在对市政污水处理厂废水的生物抑制毒性测试中发现，废水中含有较高浓度难降解的挥发性有机物（VOC）类物质生物抑制毒性明显。黄满红等〔13〕在对城市污水处理厂的毒性检测中也发现，发光细菌的发光抑制率与lnCODnb之间存在正相关，水样中的难降解化学需氧量（CODnb）的比例可能是导致细菌毒性的原因之一。本研究中，该化工企业污水处理厂同批次样品进水COD 和BOD5的浓度值见表3。

表3 某煤化工企业污水处理厂进水、出水毒性检测和COD、BOD5检测Table 3 The luminescent bacteria toxicity，COD，BOD5 test results of the inlet and outlet water of wastewater treatment plant of coal chemical enterprise

根据CODnb的计算公式〔13〕，CODnb=COD-BOD5∕0.58，计算得出1号进水样品的CODnb为101.28mg∕L，进水CODnb∕COD为58.54%；2号进水样品的CODnb为135.31 mg∕L，进水CODnb∕COD 为65.68%。3号出水样品的CODnb为12.59 mg∕L，出水CODnb∕COD为15.73%；4 号出 水样品的CODnb为12.66 mg∕L，出水CODnb∕COD 为15.25%。对比该批样品的细菌毒性结果可以发现，废污水的发光细菌抑制率与CODnb∕COD存在一定关系：1号和2号进水样品中CODnb所占进水总的COD 的比例高时，细菌毒性实验的发光抑制率也高，即毒性越强；废污水的CODnb值低时，细菌毒性实验的发光抑制率相应低，甚至出现细菌发光量增长的现象。

废污水中的污染物经污水处理厂处理后达到排放标准后，生物毒性有较大程度的消减，毒性检测结果细菌发光的衰减量非常小，经过校正系数计算后抑制率H15和H30均呈负值，即细菌发光量出现增长现象（见表3 中3、4 号批次样品）。处理后的出水引起发光细菌发光量增加的现象，可能是出水中绝大部分污染物被降解，还存在某些营养物质适合发光细菌生长。R.BOLUDA 等〔2〕曾报道，发光细菌法检测农田收集的灌溉排水的富营养化的水时并不敏感。细菌发光量增长也有可能是出水中的某种物质引起的毒物兴奋效应（Hormesis）〔14-15〕。Kaili SHEN等〔15〕在研究中发现低浓度的Cu2+和Zn2+（低 于1 mg∕L）会明显增加细菌的发光量，本研究认为Cu2+和Zn2+本身就是细胞中一些酶活性的必须金属离子，低浓度的Cu2+和Zn2+可能会刺激细胞的酶学反应系统。对比某煤化工企业同批次样品检测数据，进出水的Cu2+质量浓度差异不大，为0.009 mg∕L 左右，而进出水的Zn2+质量浓度均为＜0.05 mg∕L，该煤化工企业废污水样品的Cu2+和Zn2+质量浓度不是造成出水发光量增加的原因，影响细菌发光量增加的因素较为复杂，需进一步深入研究。

3 结论

（1）某煤化工企业污水处理厂收集的进水具有高毒性，但经过目前运行A∕O（前置反硝化）生化处理+曝气生物滤池（BAF）工艺处理后，毒性有较大程度的消减，出水无明显的综合毒性。

（2）废污水的CODnb值高时，细菌毒性实验的发光抑制率也高，废污水的CODnb值低时，细菌毒性实验的发光抑制率相应低，甚至出现细菌发光量增长的现象。

（3）煤化工企业废污水成分复杂，不同工艺路线产生的废污水特征污染物也各不相同，除急性毒性外，还存在慢性毒性和基因性毒性等，不同生物对毒性的耐受能力和毒素在体内的积累程度也不同。发光细菌法属于急性毒性测试，虽存在一定的局限性，但其快速、简便、高敏感性的优势可在企业污水处理厂的日常排水急性毒性的检测和污染物超标预警中发挥重要作用。