灵武长枣贮藏过程中活性氧代谢和水分迁移与果实硬度的相关性

王 娟，张海红*，马晓艳，高 坤，王 通

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

灵武长枣（Ziziphus jujubeMill.cv.Lingwuchangzao）是我国地理标志产品，也是宁夏红枣中最具特色的鲜食枣珍品，果实脆甜适口、鲜嫩多汁、质地酥脆、富含多种矿物质和维生素，具食疗功效。然而，灵武长枣采摘期短，上市较集中，鲜枣采摘后仍然具有较高的呼吸强度，果肉水分质量分数高达70%左右，果实外皮的气孔大、蜡质层疏松，若不进行处理，鲜枣在24 h内便会失水5%以上，俗称“三天蔫、五天软、七天食味皆无”[1]。研究发现，随着贮藏时间的延长，灵武长枣会出现乙醇积累、活性氧代谢和膜脂过氧化现象，导致果实软化，大分子物质降解，果实腐败变质，严重影响其营养特性及鲜食价值[2]。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是植物代谢中电子传递至氧分子时产生的活跃的、对组织细胞具有毒害作用的含氧物质的总称，主要包括H2O2、超氧阴离子自由基（O2-·）等[3]。一般情况下，贮藏过程中果蔬的活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，张润光[4]认为当植物受到自身衰老或外界因素胁迫时，能量物质被大量消耗，果蔬代谢产能速率迅速降低，活性氧大量积累，细胞内自由基代谢平衡失调，从而产生氧化损伤，细胞膜完整性遭到破坏，造成细胞区室化消失和离子泄露，加速细胞损伤与凋亡。能量水平和活性氧代谢均与草莓果实衰老有关，刘欢等[5]研究发现促进活性氧生成会加速草莓果实的软化，而清除活性氧有效减缓了草莓果实的硬度下降。许佳妮等[6]在柑橘果实油胞病发病过程中的膜脂代谢研究中发现发病早期果实脂氧合酶活性可以使果皮脂肪酸不饱和度下降，导致活性氧急剧积累，膜脂过氧化反应加剧；过量活性氧会攻击组织细胞膜，使得丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和相对电导率快速增长，引起蛋白质等大分子物质交联聚合以及组织细胞膜结构损伤，进而使得细胞功能失调，细胞膜结构受损，加剧油胞病症状。魏婧[7]、刘聪[8]等的研究表明，抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可以将超氧阴离子转化为H2O2，H2O2再经过氧化氢酶和过氧化物酶催化生成H2O，这一过程可有效降低脂质过氧化程度，减少脂质过氧化产物的积累，从而减轻机体损伤[9]；Chen Yihui等[10]研究发现，用酸性电解水处理蓝莓果实，可以提SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）等活性，减缓活性氧的产生。

水分是果蔬中重要的组成部分，直接影响着蛋白质变性、酶活性、硬度等众多货架期因素[11]。近年来，低场核磁共振技术逐渐被用于检测不同条件下果蔬的水分状态变化，如朱文学等[12]基于低场核磁研究了马铃薯切片干燥过程水分迁移规律，李娜等[13]利用低场核磁共振技术分析了冬瓜真空干燥过程中的内部水分变化。Zhu Danshi等[14]研究发现甜樱桃的软化与低温贮存期间的水分流失密切相关。朱丹实等[15]基于低场核磁共振技术研究了不同温度贮藏条件下秋红李子组织水分迁移规律与质构的关系，发现当贮藏温度较低时，李子质构品质和水分含量下降缓慢，同时细胞质水与果肉的硬度变化显著负相关，液泡水与质构变化呈显著性正相关。冯爱博等[16]采用低场核磁共振技术研究了不同贮藏条件下雷竹笋水分迁移规律，发现随着贮藏温度的降低，雷竹笋体内水分的流动性在不断增强，随着贮藏时间延长，不同贮藏温度下所对应的总水分弛豫峰面积A2总体呈下降趋势，说明水分在不断流失。

本实验以宁夏地区特色的枣品种之鲜食灵武长枣为实验原料，利用低场核磁共振和质构仪器分析鲜食灵武长枣水分和硬度变化，同时监测MDA含量、相对电导率等指标，研究鲜食灵武长枣贮藏过程中活性氧代谢和水分迁移与果实硬度的相关性，以期为灵武长枣贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜灵武长枣采摘于宁夏灵武市沐林杨农业发展有限公司种植基地。

考马斯亮蓝R-250（生物技术级）、牛血清白蛋白上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯）、无菌双蒸水、95%乙醇、85%磷酸、硫代巴比妥酸、三氯乙酸 上海国药集团化学试剂有限公司；MDA试剂盒、H2O2试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

DDS-307电导率仪、21G-100紫外-可见分光光度计上海仪电科学仪器股份有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机 上海卢相仪离心机仪器有限公司；HH-4电热恒温水浴锅 上海比朗仪器有限公司；BC/BD-106DT调温冰箱 长虹美菱股份有限公司；NMI20-040V-I低场核磁共振仪 上海纽迈电子科技有限公司；TA-XT2i质构仪英国Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 灵武长枣的贮藏

将采摘后的灵武长枣1 h内运回实验室，静置2 h后，挑选个体大小均匀（单果质量10 g左右）、八成熟（颜色70%～80%为红色）、无病虫害、无机械损伤的枣果灵武长枣进行实验。将灵武长枣分装于聚酯保鲜盒，每盒30 个果实，每个处理3 盒作为平行，贮藏于4 ℃冷库中，以常温贮藏（25 ℃）组作为对照，每隔4 d取样测定灵武长枣硬度、相对电导率、MDA含量、H2O2含量、核磁共振横向弛豫时间T2等各项指标，每组设置3 个平行。

1.3.2 相对电导率的测定

用直径为0.6 cm的打孔器在鲜枣样品赤道位置取柱状果肉，称取5 g于小烧杯中，蒸馏水冲洗3 次，用滤纸沾干样品表面水分，放入烧杯中，加入50 mL去离子水，静置30 min后，用电导仪测定其煮前电导率；沸水浴煮沸30 min，冷却至室温后再用电导仪测定其煮后电导率。重复测定3 次，计算平均值。按下式计算相对电导率[17]。

式中：C0表示样品煮前电导率/（μS/cm）；C1表示样品煮后电导率/（μS/cm）。

1.3.3 丙二醛和过氧化氢含量测定

MDA含量和H2O2含量均参考试剂盒说明书进行测定。

1.3.4 贮藏期间灵武长枣组织中水分迁移分析

先将标准样品置入检测管后，通过核磁共振分析应用软件中的FID（Free Induction Decay）脉冲序列自动寻找90°脉宽P1，并校正中心频率O1，然后选择CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脉冲序列检测T2弛豫图谱。再将样品切成10 mm×10 mm×20 mm的组织块，放入直径为70 mm的核磁检测管中，设置线圈温度32 ℃，调整质子的共振频率为24 MHz。使用CPMG序列，设置T2测量参数：采样频率SW＝200 kHz，模拟增益RG1＝20，P1＝16.00 μs，数字增益DRG1＝3，TD＝200 292，PRG＝1，重复采样间隔时间TW＝3 000 ms，累加次数NS＝4，P2＝34.00 μs，回波时间TE＝1，回波个数NECH＝1 000。根据CPMG指数衰减曲线图进行迭代反演，得到横向弛豫时间T2图谱。

1.3.5 硬度测定

每组每次随机选取6 个果实，在赤道中部去皮，采用质构仪测定硬度，探头为P/5平底圆柱形探头。设置测试条件：测前速率2 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，压缩距离为5 mm，停留间隔5 s，触发力5 g。以每次测定的最大值为硬度，单果重复6 次，最后取平均值。

1.4 数据处理与分析

每个指标测定均重复3 次，结果取平均值±标准差。使用SPSS 17.0软件进行数据统计处理，采用Origin 2017软件绘图，采用最小显著差异t检验法进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 灵武长枣贮藏过程中相对电导率变化

细胞膜是一种选择透过性膜，对维持植物细胞内的新陈代谢有极其重要作用。细胞膜透性的高低可以代表细胞膜的完整程度和稳定性，一定程度上反映了细胞受伤害的情况。当果蔬受到损伤时，细胞膜结构就会遭到破坏，膜透过性就会增高，继而发生膜内电解质外泄，使得相对电导率升高。因此相对电导率可以作为评判细胞膜透性的一个指标。组织相对电导率越高，细胞膜透性越大，膜受损的程度也越大[18]。如图1所示，两种贮藏条件下，灵武长枣的相对电导率不断升高，各贮藏期之间有显著性差异（P＜0.05）。4 ℃贮藏组的相对电导率总体显著低于常温贮藏组（P＜0.05）。在贮藏初期，两组贮藏条件下鲜枣的相对电导率上升比较缓慢，常温贮藏的鲜枣相对电导率在贮藏8 d后迅速增大，4 ℃贮藏的鲜枣在第12天开始快速增长。贮藏至第16天时，灵武长枣的相对电导率分别为55.57%、40.57%，4 ℃贮藏组显著低于常温贮藏组的相对电导率（P＜0.05），这与郭香凤等[19]在研究贮藏温度对西兰花净菜品质影响中的结果基本一致，说明低温可显著地抑制微生物、呼吸作用、氧化作用等，减少细胞膜的损伤，保持灵武长枣组织膜结构和功能的完整性，减轻品质劣变的程度。

图1 灵武长枣贮藏过程中相对电导率的变化Fig.1 Changes in REC in Lingwuchangzao jujube during storage

2.2 灵武长枣贮藏过程中MDA含量和H2O2含量的变化

植物贮藏过程中的活性氧自由基会引发膜脂过氧化反应，对膜的结构和功能造成伤害[20]。MDA是生物膜系统脂质过氧化的产物之一，会攻击膜、核酸、蛋白质等大分子物质，使膜结构遭到破坏，透性增加，所以可以用MDA含量来反映机体内脂质过氧化程度，间接地反映出细胞损伤的程度。H2O2是植物体内细胞活性氧代谢作用的副产物，具有较强的氧化性，H2O2的大量积累能够导致生物大分子和膜的氧化损伤。如图2、3所示，随着贮藏时间的延长，灵武长枣中的MDA和H2O2不断积累，含量呈现上升趋势，这与刘帮迪等[21]在研究杏果实贮藏过程中MDA和H2O2含量变化的结果一致。较4 ℃贮藏组，常温贮藏的灵武长枣MDA、H2O2含量上升幅度较大，且各贮藏期的MDA含量显著高于4 ℃贮藏组（P＜0.05），到贮藏末期，常温贮藏组MDA和H2O2积累量分别为贮藏初期的8 倍和4 倍左右。

图2 灵武长枣贮藏过程中MDA含量的变化Fig.2 Changes in MDA content in Lingwuchangzao jujube during storage

图3 武长枣贮藏过程中H2O2含量的变化Fig.3 Changes in H2O2 content of Lingwuchangzao jujube during storage

2.3 贮藏期间灵武长枣组织中水分迁移的结果

不同贮藏温度下新鲜灵武长枣贮藏阶段的低场核磁共振横向弛豫时间T2图谱见图4。T2与胞内氢质子的自由度及其所受的束缚力有关，氢质子自由度越大或受束缚力越小，弛豫时间T2越长，底物与水分结合程度越松散，既水分流动性越强[22-23]。从图4中可以看出，灵武长枣有3 个峰，分别代表长枣果肉组织中不同状态水的分布情况，根据弛豫时间T2，将枣中的水分分为3 种状态：结合水、不易流动水、自由水（对应弛豫面积分别为A21、A22、A23），这与王尊等[24]在带鱼冷藏过程中水分迁移特性的研究结果一致。梅成铭等[25]研究表明这3 种状态水分大致分布在菠萝蜜细胞壁、细胞质和液泡等处。

图4 灵武长枣常温（A）和4 ℃（B）贮藏过程横向弛豫时间图谱Fig.4 Transverse relaxation time (T2) spectra of Lingwuchangzao jujube during storage at room temperature (A) and 4 ℃ (B)

由图4可知，两种贮藏条件下，鲜枣水分的核磁信号峰都出现了横向位移，说明贮藏过程中各个状态的水分子存在相互转化。通过峰面积归一化法对鲜枣中不同状态水分进行定量，然后通过比较各积分面积来反映鲜枣果肉中不同状态水的含量变化。如图5所示，灵武长枣在两种贮藏条件下各贮藏阶段总水分弛豫面积A2和自由水弛豫面积A23变化趋势较一致，整体表现为显著下降趋势（P＜0.05）。常温贮藏的鲜枣自由水弛豫面积A23下降较4 ℃贮藏更快（P＜0.05），这可能和低温抑制了活性氧代谢作用，减轻了自由基对膜结构的侵害，减少了水分的散失有关；贮藏前期，常温贮藏的鲜枣A21和A22变化不明显，贮藏至4 d后，A21迅速下降（P＜0.05），而4 ℃贮藏的鲜枣结合水含量在第8天开始迅速下降。最终含量为常温贮藏的1.8 倍左右。两种贮藏条件下，A22均在第4天开始快速上升，第8天时达到峰值（图5B），这与冯爱博等[16]对雷竹笋水分迁移规律研究中水分含量的变化趋势一致，可能是因为鲜枣水分损失严重，组织结构开始收缩，自由水向组织内部迁移，与大分子基团结合引起的。此后常温贮藏的鲜枣表观出现大面积软化腐败[26]，细胞膜结构被破坏，A22迅速降低，且显著低于4 ℃贮藏的鲜枣（P＜0.05）。4 ℃贮藏的鲜枣A22下降较缓慢，贮藏至16 d时，A22约是常温贮藏的1.5 倍，说明低温能较好地减少不易流动水的迁移散失，维持鲜枣正常的生理活动。

图5 灵武长枣贮藏过程中不同状态水的弛豫面积变化Fig.5 Changes in relaxation peak areas of different water states in Lingwuchangzao jujube during storage

2.4 灵武长枣贮藏过程中硬度的变化

硬度是衡量果实质构品质的重要指标，也是果实软化程度的直观表现[27]。如图6所示，随着贮藏时间的延长，灵武长枣硬度呈现下降趋势。常温贮藏的枣果实硬度下降较快（P＜0.05），整个贮藏期内迅速下降。4 ℃贮藏的鲜枣前8 d硬度变化不显著（P＞0.05），贮藏至末期，果实迅速变软，硬度急剧下降。总体而言，常温贮藏的鲜枣果实硬度显著低于4 ℃贮藏的果实（P＜0.05），这与许娟等[28]的研究结果一致。说明低温可以抑制果实呼吸代谢，抑制酶活性，减缓果胶、纤维素等结构物质降解[29]，减缓鲜枣组织变软速度。

图6 灵武长枣贮藏过程中硬度的变化Fig.6 Changes in hardness of Lingwuchangzao jujube during storage

2.5 灵武长枣果实各指标与硬度的相关性分析结果

鲜枣贮藏过程中硬度与相关指标的相关性分析见表1，相对电导率、MDA含量和H2O2含量与果实硬度呈极显著负相关，A21、A23和A2与果实硬度呈极显著正相关，A22与果实硬度相关性不显著。各相关指标中，与硬度的相关程度依次为A2（0.929）＞MDA含量（-0.913）＞相对电导率（-0.910）＞A21（0.908）＞A23（0.907）＞H2O2含量（-0.824）＞A22（0.019）。

表1 灵武长枣贮藏过程中各指标的相关分析结果Table 1 Correlation analysis of various indexes of Lingwuchangzao jujube during storage

2.6 灵武长枣果实各指标与硬度的通径分析结果

通径分析可以反映各相关指标对鲜枣果实硬度作用的大小，由表2可知，各相关指标对果实硬度的直接通径系数绝对值依次为A21＞MDA含量＞A23＞相对电导率。由直接通径系数结果可知，相对电导率对鲜枣果实硬度起负向作用且达极显著水平，MDA含量、A21、A23对鲜枣果实硬度起正向作用且达极显著水平。相对电导率、MDA含量、A21、A23对硬度的间接作用系数差异较大，相对电导率通过MDA含量对硬度的间接作用呈现正向效应，通过A21和A23对硬度的间接作用呈现负向效应，且间接作用系数绝对值远大于直接通径系数的绝对值。各因子对果实硬度的贡献率绝对值依次为A21（0.702 8）＞MDA含量（-0.619 4）＞A23（0.605 8）＞相对电导率（0.267 9），与直接通径系数变化趋势一致。这与胡波等[30]对冬枣果实贮藏期间与软化相关的指标的相关和通径分析研究结果较一致，水分变化、相对电导率和MDA含量都是影响硬度变化的重要指标。上述性状决定了硬度变异的94.365%，同时有5.635%的变异是由其他因素和实验误差引起的。

表2 灵武长枣贮藏过程中各指标与果实硬度的通径分析结果Table 2 Path analysis of various indexes and fruit hardness of Lingwuchangzao jujube during storage

3 讨 论

硬度是影响采后鲜食枣果消费者吸引力和市场营销的重要品质指标之一。而活性氧代谢和水分流失是引起果实软化的重要因素。活性氧对组织细胞具有毒害作用，鲜枣贮藏期间，因自身衰老和外界环境胁迫，用以清除活性氧代谢产物的SOD、CAT、过氧化物酶（peroxidase，POD）等酶类被大量消耗，活性氧的产生和积累的平衡被打破，H2O2、MDA的积累和相对电导率均呈上升趋势，从而产生氧化损伤，破坏了细胞膜的完整性，加剧了果实膜脂过氧化现象[31]。活性氧代谢造成的细胞膜损伤直接影响采后鲜枣的硬度，随着贮藏时间延长，枣果硬度呈现下降趋势。低温贮藏在维护采后果蔬品质和商品价值方面具有重大意义。本实验中4 ℃贮藏的鲜枣活性氧代谢作用较缓慢，主要是因为低温可以有效降低果蔬呼吸作用，减少自由基积累，维持正常的细胞膜透性，延缓果实腐烂，延长枣果采后寿命。

枣果贮藏期间会发生水分的迁移流失，致使细胞膨压降低，同时会介导很多间接反应，包括物理、化学和呼吸代谢，致使果实内部会产生损伤，导致果实的软化[32]。随着贮藏期延长，两种储藏条件下鲜枣内各状态水分流动性逐渐增大，不易流动水弛豫面积A22呈现先上升后下降趋势，其余各状态水分的弛豫面积均呈下降趋势。4 ℃贮藏的鲜枣水分流失较缓慢，且果实的硬度显著高于常温贮藏的鲜枣（P＜0.05），一方面4 ℃贮藏的鲜枣蒸腾作用较缓慢，且水分的自由度较低；另一方面4 ℃贮藏的鲜枣前期活性氧代谢较缓慢，自由基积累较少，到了贮藏中后期，抗氧化酶能够很好地清除自由基，保护膜系统，减少了微生物侵染和水分散失，避免鲜枣因果实水分流失加快，表皮皱缩，而导致的硬度下降。

通过相关性分析和通径分析探讨各个指标与硬度变化相关性发现，A21、MDA含量、相对电导率和A23作为影响鲜枣果实硬度的4 个主要指标，相对电导率和MDA含量与硬度呈负相关且达显著水平，其余两者对硬度起正向作用。这与胡波等[30]对冬枣果实贮藏期间软化研究结果较一致，该研究发现，VC含量、有机酸含量、失水率、相对电导率、MDA含量均为影响果实贮藏期硬度变化的重要指标。另外，胡波等[33]在冬枣贮藏效果和酶活性的相关性研究中还发现，聚半乳糖醛酸酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶为果实贮藏过程中主要的酶，在贮藏过程中对果实软化衰老起重要作用，但是对灵武鲜枣软化衰老的作用有待进一步研究。灵武长枣采后仍然具有较高的呼吸代谢作用，且鲜枣果实受到逆境胁迫后，体内活性氧动态平衡会被打破，在贮藏期内，由于活性氧代谢的作用，会产生大量的超氧阴离子，进而产生H2O2，再进一步形成氧化力较强的·OH。最终导致脂质过氧化，MDA大量积累，细胞质膜受损、降解，丧失其完整性，组织对水分的束缚能力降低，引起大量的水分散失，果肉的硬度也逐渐下降。

4 结 论

综上所述，随着贮藏时间的延长，H2O2、MDA的积累和相对电导率均呈上升趋势，常温贮藏的鲜枣变化速率较4 ℃变化更加显著（P＜0.05）；由水分迁移及不同水分的弛豫面积分析可知，随着贮藏期延长，各个状态的水分子存在相互转化，两种储藏条件下鲜枣内各状态水分流动性逐渐增大，各贮藏阶段总水分的弛豫面积A2和自由水弛豫面积A23变化趋势较一致，呈下降趋势，A22呈现先上升后下降趋势，常温和4 ℃贮藏的鲜枣A21分别呈下降和先上升后下降趋势，4 ℃贮藏的鲜枣各状态水分流失较常温缓慢；硬度随贮藏期延长呈下降趋势，常温贮藏的鲜枣质构品质显著低于4 ℃贮藏的鲜枣（P＜0.05），相关分析和通径分析结果表明，A21、MDA含量、相对电导率和A23是影响鲜枣果实硬度的4 个主要指标，该研究为鲜食灵武长枣贮藏保鲜提供了理论依据。