富黄酮洋葱啤酒发酵工艺的优化

程飞宇，马立娟，李弘轩，朱振昊，张孟灏，韩帅峰，范佳钰，韩蓓

（天津科技大学 生物工程学院，天津 300457）

洋葱是一种常见的廉价家常菜，其肉质柔嫩，汁多辣味淡，品质佳，适于生食。在国外它被誉为“菜中皇后”[1]，营养价值较高。洋葱中含有丰富的黄酮类化合物及花青素，具有抗炎、抗氧化、降血压、降血脂、抑制肿瘤等生理作用[2]。洋葱不仅作为一种调味品，更是膳食中营养和功能成分的重要来源。近年来，随着人们保健意识的增强，日益强调食品原料及添加剂的天然性、功能性，因此人们更加关注洋葱的功能特性。洋葱大多被用来直接食用，除此之外，随着人们对洋葱的功能活性的深入了解和重视，洋葱的粗加工和深加工产品也越来越多。洋葱的粗加工产品主要有脱水洋葱片、洋葱酱等；深加工产品有从洋葱中提取出的黄酮、精油等[3-5]；发酵产品有洋葱醋、洋葱酒等。例如，于亚敏[6]对洋葱葡萄酒进行了开发，建立了发酵型洋葱葡萄酒的生产工艺；江成英等[7]研究了发酵生产洋葱糯米酒的主要工艺参数。随着对洋葱深加工的深入研究，越来越多的洋葱发酵产品将被研制并生产。

本研究将新鲜紫皮洋葱中的功能性物质黄酮的提取液添加到制备好的麦芽汁中进行啤酒发酵，充分利用洋葱中的功能活性成分，开发一种口味独特、营养健康的富黄酮洋葱啤酒。通过考察pH值、富黄酮提取液添加量和酵母接种量等因素对洋葱啤酒中酒精度和黄酮增长率的影响，采用Box-Behnken响应面法优化啤酒的发酵工艺，为富黄酮洋葱啤酒的开发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

洋葱（新鲜紫皮洋葱）、苹果（冰糖心苹果）：市售；麦芽、酒花（卡斯卡特酒花，α-乙酸含量4.5%～7.0%）、啤酒酵母（Weiss）：帝伯仕啤酒技术有限公司；芦丁标准品（纯度99%）：北京索莱宝科技有限公司；纤维素酶（酶活4万U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为分析纯）：南京试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

754型紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；MJ-LZ25Easy121多功能三杯榨汁机研磨机：佛山佳顿电器有限公司；DK-S82型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；SY-100E型多用途恒温超声提取仪：北京宏祥隆生物技术开发有限公司；DHG-9016A型电热恒温鼓风干燥箱：太仓精宏仪器设备有限公司；AR2140型电子分析天平：奥豪斯国际商贸（上海）有限公司；SPX250B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；EXPEC 5230气相色谱-三重四极杆质谱联用仪：杭州谱育科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麦芽汁的制备

将干燥的麦芽进行粉碎后放入锅中，随后以液料比3∶1（mL/g）向锅中加入适量的水搅拌，充分混匀。将其放置于水浴锅中，于52℃下加热30 min，随后升温至65℃保持70 min，接下来在72℃和78℃各保持10 min进行糖化，结束后过滤。将滤液煮沸并在初沸10、40 min和结束前10 min 3个时间段分别加入20%、40%、40%的酒花，然后降温过滤、离心除去杂质，最终获得澄清透明的麦芽汁。

1.3.2 富黄酮提取液的制备

将新鲜的紫皮洋葱先用自来水洗净，再用蒸馏水清洗晾干后，放入榨汁机进行粉碎。将粉碎后的洋葱汁渣倒入锥形瓶中，并向锥形瓶中添加0.5 mg/g的纤维素酶，混匀后在pH4.5、40℃条件下酶解150 min。将酶解后的洋葱汁渣进行超声处理30 min[8，11-13]，进行离心后得到富黄酮提取液。

1.3.3 富黄酮洋葱啤酒的制备工艺流程

富黄酮洋葱啤酒的制备工艺流程见图1。

图1 富黄酮洋葱啤酒的制备工艺流程Fig.1 Processing flow of flavonoid-rich onion beer

1.3.4 黄酮含量测定

标准曲线的绘制：精确配制0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，将不同体积的该标准溶液置于10 mL试管中，分别加入一定体积的5%的亚硝酸钠溶液、1%的硝酸铝溶液和4%的氢氧化钠溶液，放置15 min，在510 nm条件下测量吸光度。以芦丁的浓度c（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归分析，得到标准曲线的回归方程为A=0.011 7c+0.011 9，R2=0.997 5。

黄酮含量的计算：通过分光光度计测量发酵前和发酵后的富黄酮洋葱啤酒在510 nm条件下的吸光度，再根据之前得到的芦丁标准曲线方程，代入求出不同样品所对应的黄酮浓度，进而确定样品中黄酮的含量。

黄酮增长率的计算：根据得到的发酵前后洋葱啤酒的黄酮含量来计算不同发酵条件下的黄酮增长率，公式如下。

式中：R为黄酮增长率，%；M2为啤酒发酵后的黄酮含量，μg/mL；M1为啤酒发酵前黄酮的含量，μg/mL。

1.3.5 酒精度的测定

按照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》，乙醇体积分数采用酒精计法测定。

1.3.6 啤酒中风味物质的测量

通过气相色谱仪测定啤酒的风味物质（高级醇类和酯类）的含量[14-15]。

1.3.7 啤酒发酵单因素试验

固定发酵时间为7 d，分别探究洋葱啤酒发酵过程中 pH 值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、富黄酮提取液添加量（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、酵母接种量（100、120、130、140、160 μL/100 mL）对富黄酮洋葱啤酒酒精度和黄酮增长率的影响。

1.3.8 响应面优化

对试验优选的因素采用响应面优化分析法，通过Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken design（BBD）试验设计[16-20]。

1.4 数据处理

单因素和响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.6软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素试验结果显示，当pH值为5.0～6.0，富黄酮提取液添加量为0.5%～2.0%，酵母接种量为120μL/100 mL～160 μL/100 mL时，样品的酒精度较佳，黄酮增长率在此范围内有最大值。因此，以最适发酵时间7 d为基础，采用响应面法对单因素试验结果进一步优化以确定最佳发酵条件。

2.2 响应面试验设计与结果

2.2.1 BBD试验设计及结果

采用Design-Expert8.0.6软件进行BBD试验方案设计与结果分析，结果如表1所示。以发酵液的酒精度和黄酮增长率为因变量进行双值响应面分析，结果见表2。

表1 BBD因素及水平Table 1 Factors and levels of BBD

表2 BBD方案及响应值Table 2 Scheme and response value of BBD

对得到的结果进行拟合，分别得到酒精度（Y1）和黄酮增长率（Y2）与富黄酮提取液添加量、pH值、酵母接种量之间的二次多项回归方程：Y1（酒精度）=4.53-0.60A-0.33B-0.059C+0.087AB-0.25AC+7.500×10-3BC+0.39A2-0.71B2+0.55C2；Y2（黄酮增长率）=40.16-0.59A-3.97B+4.25C-1.56AB-0.64AC+1.95BC-2.82A2-2.26B2-9.34C2。

对得到的试验数据进行方差分析，结果见表3。

表3 BBD试验中酒精度和黄酮增长率二次回归方差分析结果Table 3 Results of quadratic regression analysis of variance of alcohol content and flavonoid growth rate in BBD test

由表3可知，酒精度的回归模型显著（P＜0.05），失拟项不显著（P＞0.05）；黄酮增长率的回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明该回归模型与实际情况比较吻合，可用于洋葱啤酒的制备工艺分析和预测。在回归模型中，A、B2对于酒精度的影响极显著，B、C2对于酒精度影响显著；B、C、C2对于黄酮增长率的影响极显著，在所设计的试验范围内各因素对酒精度的影响顺序为富黄酮提取液添加量＞pH值＞酵母接种量，对黄酮增长率的影响顺序为酵母接种量＞pH值＞富黄酮提取液添加量。

2.2.2 交互项对酒精度和黄酮增长率影响

图2为洋葱啤酒发酵过程中pH值、富黄酮提取液添加量和酵母接种量这3个因素两两之间的交互作用对啤酒的酒精度和黄酮增长率的影响的三维响应图。

图2 交互作用对富黄酮洋葱啤酒中的酒精度和黄酮增长率的影响Fig.2 Effect of interaction on alcohol content and growth rate of flavonoids in flavonoid-rich onion beer

根据图2分析可得知，当富黄酮提取液添加量（A）、pH值（B）和酵母接种量（C）两两相互作用时，AC和BC的等高线的椭圆度较大，3D曲面的坡度较陡，说明AC和BC的交互作用对黄酮增长率的影响显著，其中富黄酮提取液添加量（A）和酵母接种量（C）的交互作用对黄酮增长率的影响最大，这与回归模型方差分析的结果一致。

2.2.3 最优条件与验证

根据软件分析可知，获得最大黄酮增长率的优化条件为富黄酮提取液添加量1.338%，pH5.07，酵母接种量142.68 μL/100 mL，在该条件下预测得到黄酮增长率为42.11%，酒精度为4.20%vol；获得最佳酒精度的优化条件为富黄酮提取液添加量1.316%，pH5.83，酵母接种量157.49 μL/100 mL，在该条件下预测得到黄酮增长率为33.99%，酒精度为4.30%vol。综合考虑，确定最佳发酵条件为富黄酮提取液添加量1.338%，pH5.07，酵母接种量 142.68 μL/100 mL，考虑实际工艺条件，调整最优发酵工艺条件为富黄酮提取液添加量1.3%，pH5.1，酵母接种量 143 μL/100 mL，根据所选取的各个参数进行验证试验。结果表明，在此条件下所得到的富黄酮洋葱啤酒的黄酮增长率为41.9%，酒精度为4.30%vol，与预测值相对误差在1%以内，实际值与预测值拟合较为良好，具有实际参考价值。

3 结论

本文以开发洋葱深加工产品为目标，将紫皮洋葱中的功能性物质黄酮应用于啤酒发酵，对富黄酮洋葱啤酒的酿造工艺运用单因素试验初步确定最适条件，然后利用响应面法，以酒精度和黄酮增长率为响应值，对洋葱啤酒发酵过程中的酵母接种量、pH值、富黄酮提取液添加量进一步进行优化，分别建立待优化变量与响应值之间的回归模型，通过模型检验与显著性分析，确定最佳发酵条件，并进行试验验证。优化结果表明富黄酮洋葱啤酒的最佳发酵条件：100 mL麦芽汁中，富黄酮提取液添加量为1.3 mL，pH值为5.1，酵母接种量为143 μL。在此条件下，最终产品的酒精度为4.30%vol，黄酮增长率为41.9%。得到的洋葱啤酒中黄酮含量较高，清澈透明，颜色偏红，口感醇正。