线粒体相关凋亡因子2在肝细胞癌中的表达及其基因调控网络

罗可，刘添皇

（广东省梅州市人民医院肝病科，广东梅州514031）

原发性肝癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率居所有恶性肿瘤的第6 位[1-3]。在原发性肝癌中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占85%～90%，是肝癌最主要的病理学类型。HCC 的恶性程度高，早期症状隐匿，大部分患者就诊时已经是中晚期，其治疗效果不佳[3-4]。根治性切除是HCC 的主要治疗方法，但是大部分患者在手术之后不可避免存在复发和转移，最终导致患者死亡。HCC 对传统的放化疗抵抗，早期诊断和及早识别复发转移的高危HCC 患者是进一步提高肝癌预后的关键[5-6]。

肿瘤细胞在死亡机制方面往往存在某种缺陷，这也是导致恶性肿瘤治疗失败的一个重要原因。为了满足生长的需要，肿瘤细胞比普通非肿瘤细胞对铁的需求量通常更高。这种对铁的依赖使肿瘤细胞更容易发生铁催化相关的死亡，即铁死亡[7-9]。铁死亡是铁离子依赖型的细胞坏死，是一种新发现的细胞死亡类型，不同于传统的细胞凋亡和坏死，它是铁依赖性脂质过氧化物积累的结果[10-11]。越来越多的证据表明，铁死亡可作为抗肿瘤作用的新靶点[12-14]。最新的研究发现，线粒体相关凋亡因子2（apoptosis-inducing factor, mitochondrionassociated 2，AIFM2）是一个铁死亡的关键调控因子[15-16]。AIFM2 通过编码黄素蛋白氧化还原酶与DNA 单链结合，从而促进细胞凋亡[17-19]。同时有研究发现，AIFM2 是P53 靶向调控基因，参与多种恶性肿瘤的发生发展。AIFM2 在乳腺癌和小细胞肺癌中具有非常重要的调控作用，AIFM2 在核内累积可引发细胞死亡[20]。

目前，关于AIFM2 在HCC 中的表达及功能尚不清楚，AIFM2 的表达与HCC 患者的临床病理因素的关系也是未知。因此，本研究选取AIFM2 基因作为本研究的研究目标，通过生物信息学全面分析AIFM2 基因在HCC 中的表达和相关基因调控网络，为HCC 诊断和预后判定提供潜在的新的分子标志物。

1 材料与方法

1.1 Oncomine分析

Oncomine数据库 （https://www. oncomine. org/resource/login.html）是一个恶性肿瘤相关基因芯片数据平台，该数据库收集了大量癌基因表达数据资料，包括癌组织和正常组织的DNA 和RNA 的检测数据，以及相关患者的临床资料[21]。本研究纳入Oncomine 数据库多个HCC 研究数据队列，包括Chen liver，Wurmbach liver 研究等。在Oncomine 数据库中，比较AIFM2 在HCC 组织和正常组织的中表达差异，当P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2 UALCAN分析

UALCAN （http://ualcan.path.uab.edu） 是一个基于TCGA 数据库的在线分析平台。UALCAN 数据平台可以方便快速的获取TCGA 数据库内的癌症测序数据，可以用来探讨基因表达与患者的临床病理特征以及总生存之间的关系，也可用来分析基因表达之间的关联性[22]。本研究通过UALCAN 数据库分析AIFM2 在HCC 中的表达及意义。利用UALCAN数据库分析HCC 中AIFM2 的表达水平，并分析其与肿瘤分期、种族、性别、病理亚型等之间的关系，并进行生存分析。

1.3 LinkedOmics分析

LinkedOmics 数据库（http://www.linkedomics.org/login.php）是一个基于网页的平台，可用于分析32 个与TCGA 癌症相关的多维数据集[23]。本研究通过LinkedOmics 研究TCGA 数据库HCC 组织中的AIFM2表达对患者肿瘤大小（T 分期）、淋巴结转移（N 分期）、远处转移（M 分期）、年龄、种族和预后等的影响。随后，利用LinkFinder 模块分析TCGA 数据库HCC 队列中与AIFM2 相关的差异表达基因，根据Pearson 相关系数分析在HCC 中与AIFM2 显著表达相关的基因，结果以火山图和热图显示。利用 LinkFinder 模块基因富集分析 （Gene Set Enrichment Analysis，GSEA） 对差异相关基因进行GO[细胞成分（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）]分析，KEGG 信号通路分析、激酶靶标富集、miRNA 靶标富集和转录因子靶标富集。

1.4 cBioPortal分析

cBioPortal 是一种开放获取的网络分析数据资源，可用于多种癌症的基因组学数据的综合性探索，可用于探索基因的突变，拷贝数变异（CNV）和mRNA 表达情况[24]。本研究中，使用cBioPortal 分析TCGA 数据中372 例HCC 标本中的AIFM2 基因变异频率和类型。

1.5 GeneMANIA分析

GeneMANIA 在线数据库（http://www.genemania.org）是一个可用于构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）的网络平台，该平台可以根据基因组学和蛋白质组学数据进行识别和扩展指定基因功能相似的基因列表[25]。GeneMANIA 还可以根据每个所选查询数据集的预测值进行权重评估。本研究采用GeneMANIA 平台探讨AIFM2 可能存在相互作用的基因网络。

2 结 果

2.1 HCC 中AIFM2 的表达及其与临床病理因素的相关性

Oncomine 4.5 数据库的多个数据队列分析显示，在HCC 组织中AIFM2 的mRNA 表达和DNA 拷贝数均明显高于正常组织（P＜0.01）（图1）。从整合TCGA 数据集的UALCAN 网站进一步分析AIFM2在TCGA 数据库的HCC 中的表达情况，同时基于肿瘤临床分期、病理亚型、淋巴结转移状态等进行了分组分析。结果发现，在HCC 中AIFM2 水平明显高于正常组织（P＜0.001）（图2A）；肿瘤分期越晚、病理分级越高，AIFM2 的表达量也越高（均P＜0.001）（图2B-C）；伴有淋巴结转移（N1）患者的AIFM2 表达量显著高于无淋巴结转移（N0）的患者（P＜0.001）（图2D）；AIFM2 在HCC 中的表达量随着患者年龄的增高而逐渐增高（P＜0.001）（图2E）；伴有TP53 基因突变患者的AIFM2 表达量也显著高于非TP53 基因突变的患者（P＜0.001）（图2F）；肿瘤高分化患者的AIFM2 表达量显著高于低分化的患者（P＜0.001）（图2G）。AIFM2 的表达水平与患者的总生存（overall survival，OS）明显相关，AIFM2 高表达患者的预后显著差于低表达患者（P=0.034）（图2H）。

2.2 HCC中AIFM2的相关性表达分析

为了明确AIFM2 的潜在调控网络，通过Person相关性分析探讨与AIFM2 表达显著相关的基因（图3A），结果提示TYSND1、DNAJB12、MRPS16、EXOSC1和CUTC是与AIFM2呈正相关最明显的前5个基 因（图3B）， 而PDLIM5、 FNIP2、 AKAP9、PPAP2B 和BRWD1 是与AIFM2 负相关差异最显著的前5 个基因（图3C）。

2.3 GO功能注释和KEGG信号通路分析

在LinkedOmics 数据分析平台，对AIFM2 及其在HCC 中显著表达相关基因进行GSEA 富集分析，其富集的生物学功能主要体现在核糖体和线粒体结构组成、转录起始、NADH 还原酶、呼吸链传递、rRNA 结合和氧化磷酸化（图4A-C）。通过KEGG 信号通路富集分析发现，AIFM2 及显著相关基因在HCC 中主要参与了核糖体相关功能、氧化磷酸化、RNA 聚合酶和铁死亡相关信号通路等（图4D）。

2.4 HCC 中与AIFM2 表达相关的激酶、miRNA 或转录因子网络

为了进一步探索HCC 中AIFM2 的相关调控网络，通过GSEA 分析发现了多个与AIFM2 表达统计学相关的激酶、miRNA 和转录因子。与AIFM2 相关最显著的前5 个激酶分别是激酶MAPK1、MAPK7、MAPK3、RPS6KA1 和FGR。与AIFM2 相关最显著的前5 个miRNA 分别是miR-30 家族（miR30A-5P、miR-30C、miR-30D、miR-30B、miR-30E-5P）、 miR-1/206cluster、 miR-18 （miR-18a/b）、miR-183、miR-221/222 cluster。与AIFM2 相关最显著的前5 个转录因子分别是NFAT、EN1、CEBP、PAX4 和PAX8（表1）。

2.5 HCC中AIFM2的基因组改变情况

鉴于AIFM2 在HCC 中存在mRNA 水平的转录异常，拟进一步分析AIFM2 在DNA 层面是否存在异常改变。通过cBioPortal 分析TCGA 数据库中372 例HCC 的突变频率和类型，结果显示372 例HCC 患者中只有5%患者的AIFM2 发生了改变（图5）。这些改变包括：基因扩增上调2 例（0.54%） 和mRNA上调15 例（4.03%）。因此，在HCC 中，AIFM2 的基因突变发生率非常低。

2.6 AIFM2的PPI蛋白互作网络

通过GeneMANIA 分析AIFM2 的PPI 蛋白互作网络，结果提示：AIFM2 与氨甲基转移酶（AMT）、抑癌基因TP53、硫代硫酸巯基转移酶样域含蛋白1（TSTD1）、D-2-羟基戊二酸脱氢酶（D2HGDH）、乳酸脱氢酶D（LDHD）等存在相互作用（图6）。

3 讨 论

HCC 是原发性肝癌中最常见的病理类型[26]。目前，HCC 的治疗以手术、介入治疗和靶向治疗为主。虽然近年来各种治疗手段的进步，HCC 的预后较前明显改善。但是，治疗后的复发和转移仍然非常常见。肝癌的早诊早治是提高患者生存率的关键。因此，发现和鉴定更多分子标志物用于肝细胞的早期诊断和预后预测是非常迫切的。铁死亡是近年来一个研究的热点，参与铁死亡相关通路的基因被认为与肿瘤的发生发展有着非常密切的关系。AIMF2 是一个铁死亡信号传导通路的关键调控基因。但是，AIFM2 在HCC 中的诊断和预后价值目前尚不清楚。为了探讨AIFM2 在HCC的诊断和生存预测中的价值，本研究通过生物信息学平台分析AIFM2 是否与HCC 的临床病理特征及生存预后相关，并挖掘AIFM2 在肝细胞中参与的各种调控网络，从而为阐明AIFM2 在HCC 中发挥的作用及分子机制奠定基础。

我们对AIFM2 在HCC 组织中表达水平进行探讨，并分析AIFM2 表达与HCC 的临床病理因素是否相关联。结果发现，AIFM2 在HCC 中的表达水平显著高于正常组织，这就提示AIFM2 可能是个促癌因子。进一步分析发现，AIFM2 的表达量与肝细胞的侵袭性显著相关。AIFM2 在分期更晚或伴有淋巴结转移的肝细胞中表达水平更高。此外，AIFM2 还与HCC 的分化有关，在低分化的HCC 中的AIMF2 的表达量显著高于高分化的HCC。AIFM2在HCC 中表达水平还与抑癌基因TP53 的突变状态显著相关，伴有TP53 基因突变的AIFM2 表达量显著高于非TP53 基因突变的患者。由此，推测AIFM2 可能与TP53 突变体存在调控关系。最后生存分析发现，AIFM2 的表达水平与HCC 的患者的生存预后密切相关，AIFM2 高表达预示着HCC 患者的预后不良。这些结果说明，AIFM2 是HCC 潜在的诊断和预后标志物。

鉴于AIFM2 与HCC 患者的预后显著相关，笔者推测AIFM2 可能在HCC 中具备调控作用。因此，本研究探讨了AIFM2 在HCC 中表达显著相关的基因。相关性研究发现，AIFM2 和一些促癌基因具有显著的关联性，比如MRPS16 基因。MRPS16 可通过PI3K/Akt/Snail 信号转导轴促进肿瘤进展[27]。AIFM2 与卵泡蛋白相互作用蛋白FNIP2 呈现负相关，而FNIP2 在肾脏肿瘤中发挥抑癌作用[28]，这也从另外一个方面提示AIFM2 可能发挥促癌作用。此外，本研究还通过GSEA 发现了多个与AIFM2 相关联的激酶、微小RNA （miRNA） 和转录因子。GO 和KEGG 分析表明，AIFM2 相关联的基因主要富集在线粒体和核糖体功能相关通路，与细胞的氧化磷酸化和转录后翻译等密切相关。我们发现HCC 癌中的AIFM2 的表达和MAP2K1/37、RPS6KA1和FGR 等蛋白激酶显著相关。MAPK 激酶参与细胞的生长、分化和凋亡，该类激酶的过度激活与肿瘤发生发展密切相关。RPS6KA1 和FGR 激酶也是被广泛报道参与肿瘤恶性进展的蛋白激酶，亦是恶性肿瘤治疗领域非常有潜力的靶点。

miRNA 主要通过与靶基因的3'UTR 完全或不完全结合来降解靶基因的mRNA 或抑制其翻译过程，通过转录后调控，进而影响细胞增殖、分化、凋亡和其他生命活动。我们的研究发现了多个与AIFM2 表达相关联的miRNA，例如miR30 家族、miR18 和miR183。Croset 等[29]曾报道miRNA-30 家 庭成员在乳腺癌主要发挥一个抑癌的作用，它们通过直接靶向多个转移相关基因来抑制乳腺癌的侵袭、转移。Sanchez-Mejias 等[30]发现在HCC 中miR-18a 的上调与患者预后不良以及促进肝癌细胞增殖有关。

本研究为AIFM2 作为HCC 诊断和预后的分子标志物提供了初步的证据。AIFM2 作为一个铁死亡的关键调控因子，在HCC 中能够可能发挥重要的调控作用。AIFM2 在HCC 中与一些蛋白激酶（如MAPK3/7 和RPS6KA1）、miRNA（例如miR30 家族）和转录因子（如NFAT）等在表达上具有显著的关联性。这些研究结果为AIFM2 在HCC 中的后续研究奠定基础，有望为HCC 的诊疗挖掘新的靶点。但是，本研究的结果主要根据生物信息学挖掘，尚未在临床标本进行广泛验证。因此，AIFM2 的表达对HCC 的影响及其具体分子机制需要后续仍进一步研究。此外，AIFM2 对HCC 铁死亡层面的影响值得进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。