缺氧诱导的lncRNA AC114803在肝细胞癌中的表达及其作用

肖雪莲，刘润坤，涂康生

（西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安710000）

原发性肝癌是世界第五大常见肿瘤，其中75%～85%为肝细胞癌（HCC），而中国该病发病例数约占全球的45.3%[1]。尽管现有治疗手段如手术切除、局部射频消融治疗和介入治疗等取得了不错的进展，但由于较高的复发和转移率，HCC 患者的5年生存率仍不到12%[2]。越来越多的研究表明在HCC 中存在大量分子的异常表达，在癌症进程中发挥重要的调控作用[3-4]。进一步探索HCC 进展的机制将有助于治疗方法的改进，最终改善患者预后。

实体肿瘤中，由于肿瘤细胞的快速增长对氧的大量消耗导致缺氧微环境的产生，缺氧进一步诱导肿瘤细胞适应性地表达缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），而HIF-1α 参与调控多种靶基因的表达，进而促进肿瘤细胞的多种恶性生物学行为[5-6]。长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNA）是一类长度＞200 核苷酸的非编码RNA，在包括HCC 在内的多种肿瘤中表达紊乱，并影响患者预后[7-8]。研究[9-10]发现，缺氧不仅可以调控蛋白编码基因的表达，同时也可以诱导lncRNA 的表达。缺氧诱导的lncRNA 表达可通过多种机制影响细胞的增殖、迁移和代谢，进而影响患者预后[11-12]。然而，仍有很多缺氧反应性lncRNA，以及这些lncRNA 调控肿瘤进程的机制有待发现。本研究通过芯片发现了HCC 细胞中的缺氧反应性lncRNA AC114803，并进一步探索了其对HCC 生物学功能的影响及可能的机制，以期更好地理解HCC 进展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 数据来源

本研究下载了TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）中HCC 的转录组数据（HCC 组织374 例，正常组织50 例），同时获取了患者的生存时间。

1.2 实验材料

人HCC 细胞系HCCLM3 和Hep3B 购买于中科院上海细胞库，缺氧培养箱（PHCbi），Dulbecco 的改良Eagle 培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM） （Sigma）， 青霉素- 链霉素双抗（HyClone），胰酶及胎牛血清（Gibco），RNA 提取试剂TRIzol（Life technologies），RNA 反转录试剂盒（ThermFisher）， SYBR Premix Ex Taq ™ II Kit（Takara），AC114803 过表达质粒和阴性对照质粒、AC114803 引物，18S 引物（北京擎科），RIPA 细胞裂解液，BCA 蛋白定量试剂盒，5×蛋白示踪缓冲液，转染试剂lip8000，CCK-8 试剂盒（碧云天），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，增强化学发光（enhanced chemiluminescent，ECL）试剂（Millipore），N-cadherin，E-cadherin，vimentin，β-actin 抗体（Proteintech），bcl-2，bax，CCND1 抗体（Santa Cruz）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 人HCC 细胞HCCLM3 和Hep3B 培养于含1%双抗、10%胎牛血清的DMEM 培养基中，并放置于5%CO2或1%O2的37 ℃培养箱中培养。

1.3.2 lncRNA 芯片 Hep3B 细胞分别在常氧（20%O2）和缺氧（1%O2）条件下培养48 h，然后，使用TRIzol 试剂从Hep3B 细胞中分离总RNA，通过NanoDrop ND-1000 测量RNA 数量和质量。根据制造商的标准方案，应用上海数谱生物的Arraystar Human LncRNA Arrays V5 芯片鉴定不同培养条件下Hep3B 表达的lncRNA 和 mRNA。 芯片数据（GSE155505）被上传到GEO 数据库。

1.3.3 细胞转染 将处于生长对数期的HCCLM3 和Hep3B 细胞计数，按照3×105个细胞/孔接种于6 孔板中，待细胞融合度达约50%时进行转染。按照lip8000 试剂转染说明书，将2.5 μg AC114803 质粒或阴性对照质粒稀释至125 μL 无血清培养基，4 μL lipo8000 稀释至125 μL 无血清培养基，两者混合后加入6 孔板细胞中，24 h 后换液，继续培养至48 h。48 h 收取细胞并提取RNA 进行qRT-PCR 检测转染效率，同时收取细胞并提取蛋白进行蛋白质免疫印记实验，其余细胞进行后续功能学试验。

1.3.4 RNA 提取和qRT-PCR 参照TRIzol 说明书将TRIzol 加入细胞中提取总RNA。用核酸仪测定RNA 浓度后，取1 μg RNA 按PrimeScript RT 试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA,反应条件为：16 ℃30 min，42 ℃30 min，72 ℃10 min。取3 μL cDNA按照SYBR Premix Ex Taq™II Kit 说明书进行qRTPCR，反应条件为：98 ℃10 min，98 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共50 个 循环。反转录及qRT-PCR 在BIO-RAD CFX96 上进行。AC114803 正向：5'-CCT CTG GGG ACT TGG ACT GAT-3'，反向：5'-TGC TCT GG TGT CCT CTC TGT A-3'；以 人18s 为内参，18s 正向：5'-CGG CGA CGA CCC ATT CGA AC-3'，反向：5'-GAA TCG AAC CCT GAT TCC CCG TC-3'。采用2-ΔΔCt法计算AC114803 的相对表达量。

1.3.5 CCK-8 试验 细胞转染48 h 后按5 000 个/孔接种于96 孔板，每组实验设5 个复孔。于5% CO2、37 ℃培养箱中培养0、24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，培养箱孵育1 h，酶标仪测定450 nm 波长处的吸光度值（OD 值）。

1.3.6 细胞划痕试验 细胞转染48 h 后，用枪头在每孔细胞中十字交叉画出4 条直线，PBS 洗涤细胞，加入新鲜培养液，拍照，此时为0 h，继续培养48 h 后拍照为48 h。细胞迁移率=（宽度0h-宽度48h）/宽度0h×100%。

1.3.7 Western blotting 试验 按照RIPA 试剂盒步骤，在4 ℃条件下充分裂解细胞提取总蛋白。采用BCA 法进行蛋白定量，取20 μg 总蛋白加入5×上样缓冲液后100 ℃煮沸5 min 变性蛋白。将变性蛋白质在10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶上电泳后转印至PVDF 膜，用5%封闭牛奶封闭2 h，膜与一抗（Ncadherin：1∶2 000；E-cadherin：1∶2 000；vimentin：1∶1 000；bcl-2：1∶1 000；bax：1∶1 000；CCND1：1∶1 000；β-actin：1∶2 000）4 ℃孵育过夜，将膜与二抗（1:3 000）室温孵育1 h，用ECL 发光液显影，最后用Amersham™Imager 680 凝胶成像仪拍照。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析。符合正态分布、方差齐性的计量资料的两组间比较使用t检验，方差不齐性计量资料的两组间比较使用非参数检验。表达量采用均数±标准差（±s）表示。根据AC114803 表达中位值将患者分为高、低表达组，使用R 语言的survival 包绘制生存曲线，采用Kaplan-Meier 法计算其与生存的相关性。P＜0.05 视为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 缺氧对HCC细胞AC114803表达的影响

将Hep3B 细胞缺氧处理48 h 后通过芯片检测缺氧相关的lncRNA，结合TCGA 预后分析，图1A展示了与HCC 患者预后有关的缺氧诱导变化倍数较大的lncRNA。通过qRT-PCR 进一步验证，发现在HCC 细 胞HCCLM3 和Hep3B 中 仅AC114803 可 被缺氧诱导表达（图1B-C）。

2.2 AC114803表达与HCC患者预后的关系

通过TCGA 数据分析发现AC114803 在HCC 组织中表达水平明显高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2A）。根据AC114803 表达中位值将患者分为高表达组和低表达组，采用Kaplan-Meier 法计算其与总生存时间的相关性，生存曲线显示，AC114803 高表达组患者的总生存率明显低于AC114803 低表达组（P＜0.05）（图2B）。以上结果提示AC114803 在HCC 中可能发挥促癌作用。

2.3 AC114803对HCC细胞增殖的影响

在 HCC 细胞 HCCLM3 和 Hep3B中转染AC114803 过表达质粒和阴性对照质粒，用RTqPCR 检测转染效率，结果显示AC114803 质粒组和阴性对照组的AC114803 相对表达量分别是345 310±27 377 和1.000±0.271（HCCLM3），70 510±2 589 和1.000±0.164（Hep3B），差异均有统计学意义（均P＜0.05）（ 图3A-B）。 通 过CCK-8 试验检测AC114803 对细胞增殖能力的影响，结果显示，自转染后第3 天，AC114803 过表达组细胞增殖能力明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图3C-D），提示过表达AC114803 可以促进HCC 细胞的增殖能力。

2.4 AC114803对HCC细胞迁移的影响

为了进一步探索AC114803 对细胞迁移能力的影 响， 在HCC 细 胞HCCLM3 和Hep3B中转染AC114803 过表达质粒和阴性对照质粒48 h 后进行细胞划痕试验。结果显示AC114803 质粒组和阴性对照组的细胞迁移率分别为0.490±0.018 和0.296±0.084 （HCCLM3）， 0.507±0.065 和 0.312±0.056（Hep3B），差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图4A-B），提示过表达AC114803 可以促进HCC 细胞的迁移能力。

2.5 AC114803对细胞增殖和迁移相关蛋白表达的影响

为了揭示AC114803 促进HCC 细胞增殖和迁移能力的潜在机制，在HCC 细胞HCCLM3 和Hep3B 中转染了AC114803 过表达质粒和阴性对照质粒，48 h后检测了细胞增殖和迁移相关蛋白的表达。结果显示AC114803 过表达组间叶细胞标志物N-cadherin和vimentin 表达上调，而上皮细胞标志物E-cadherin表达下调，提示AC114803 可能通过促进上皮间质转化过程促进细胞的迁移；同时发现AC114803 过表达组抗凋亡蛋白bcl-2 表达上调而促凋亡蛋白bax表达下调，细胞周期蛋白CCND1 表达上调，提示AC114803 可能通过抑制细胞的凋亡、调控细胞周期促进HCC 细胞的增殖（图5）。

3 讨 论

HCC 中存在大量基因的表达紊乱，包括编码基因和非编码基因[13]。lncRNA 作为非编码基因，在HCC 中常异常表达并参与调控肿瘤进程[14-15]。肝肿瘤中常存在不同程度的缺氧，并导致HIF-1α 适应性的激活，从而改变下游靶基因的表达[5,16]。因此，进一步地探索缺氧反应性lncRNA 与HCC 的关系将有助于更好地理解HCC 发生发展的分子机制[17-18]。本研究通过芯片检测发现缺氧可诱导Hep3B 细胞中多种lncRNA 的表达，并进一步通过qRT-PCR 在HCC 细胞中验证发现了一个新的缺氧诱导性lncRNA AC114803。通过TCGA 数据分析发现AC114803 在肿瘤组织中表达上调，其高表达与患者预后不良有关，提示AC114803 可能参与调控HCC 的疾病进程。研究报道多种缺氧反应性lncRNA 如AC099850.4、MIR210HG 和NRAV可联合作为HCC 的独立预后标志物[19]。这些研究结果表明缺氧反应性lncRNA 可能参与调控了肿瘤进展，进而影响患者预后。

缺氧反应性lncRNA 通过影响肿瘤的多种生物学行为调控肿瘤进展，如肿瘤细胞的增殖、迁移、血管侵犯、代谢特性等[11-12,20]。 本研究发现AC114803 可促进HCC 细胞的增殖和迁移，进一步机制探索发现AC114803 促进抗凋亡基因bcl-2 表达，而抑制促凋亡基因bax 表达，同时促进细胞增殖标志物CCND1 的表达，提示AC114803 可能通过抑制细胞的凋亡促进细胞的增殖。多个研究表明缺氧诱导lncRNA 表达上调，并通过不同机制促进肿瘤细胞的增殖。Wang 等[21]研究发现MIR31HG 通过靶向作用于HIF-1α 和P21 调控细胞周期进程，抑制细胞凋亡，从而促进头颈癌细胞的增殖。Zhou 等[22]研究发现HIF-1α 可以激活lncRNA RAET1K 转录，RAET1K 沉默显著抑制HCC 细胞增殖和侵袭并阻断缺氧诱导的乳酸浓度和葡萄糖摄取的增加，提示缺氧诱导性lncRNA 可能作为潜在的治疗靶点。另外，本研究发现AC114803 可促进间叶细胞标志物N-cadherin 和vimentin 的表达，而抑制上皮细胞标志物E-cadherin 的表达， 表明AC114803 可能促进HCC 细胞的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程，减弱细胞的黏附能力，从而促进细胞的迁移。EMT 是上皮细胞获得间质细胞特征的过程，在上皮肿瘤中常被激活，从而促进肿瘤细胞迁移、肿瘤干性和化疗抵抗等[23-24]。lncRNAs 可通过调控EMT 过程影响肿瘤进展，研究发现lncRNA-PNUTS 通过靶向作用于miR-205 激活乳腺癌细胞的EMT 过程，表现为vimentin 表达增强和E-cadherin 表达减弱，最终促进癌细胞的迁移和侵袭[25]。

由于缺氧可诱导HIF-1α，HIF-2α 等多种分子表达上调[26]，后期需要进一步探索缺氧是通过何种机制诱导AC114803 的表达。lncRNA 可竞争性结合相应的miRNA 而相互调控[27-28]，也可以通过表观遗传学调控基因的表达等机制影响细胞的增殖、分化和凋亡等多种生物学行为[29-30]，故下一步需要探究AC114803 具体通过哪个靶点来调控增殖和迁移相关蛋白的表达。

总之，本研究新发现了HCC 中的缺氧诱导性lncRNA AC114803，其高表达导致患者预后不良,这可能与AC114803 促进HCC 细胞的增殖和迁移能力有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。