肝细胞癌免疫相关lncRNA预后风险模型的建立与评估

彭双，谭英征，杨秋红，易来

（中南大学湘雅医学院附属株洲医院1.感染内科2.血液科，湖南株洲412007）

在全球范围内， 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是排名第6 位的恶性肿瘤，2018年全球约有841 080 例新发病例和781 631 例死亡病例[1]。根据美国疾病控制与预防中心的数据，2009—2016年之间，HCC 的病死率上升了25%[2]。尽管目前对HCC 的治疗有手术治疗、肝移植、射频消融、栓塞治疗、靶向治疗和放化疗等多学科综合治疗，但HCC 的病死率和复发率仍呈上升的趋势[3-4]。因此在临床中迫切需要采取新的干预措施来改善HCC 患者的预后。HCC 通常起源于慢性肝损伤，尤其是乙型病毒性肝炎[5]。对HCC 患者的预后评估将有助于制定更好的治疗策略。常规临床实践中已采用了多种分期系统，例如巴塞罗那临床肝癌系统[6]。但是，目前尚未建立基于分子生物标志物的临床分层系统来识别高危HCC 患者。

长非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 个核苷酸的非编码RNA。越来越多的研究表明，lncRNA 在调节广泛的生物学过程中起着重要作用，包括基因表达，细胞生长，分化和染色体分裂[7]。在各种类型的癌症中都检测到异常表达的lncRNA，并且某些lncRNA 表现出致癌或抑制肿瘤的作用，这表明了其可能作为肿瘤潜在的生物标志物和治疗靶点[8-9]。并且研究发现与mRNA 和微小RNA（miRNA）相比，lncRNA 是卓越的肿瘤生物标志物[10-11]。目前，尽管对lncRNA的生物学功能的报道相对较少，但越来越多的研究表明lncRNA 可以为多种类型的肿瘤提供重要的预后价值[12-15]。随着新一代测序技术的应用和普及，大量有关肿瘤的高通量测序数据使得利用生物信息学预测肿瘤中lncRNA 功能成为可能。

本研究中，通过利用TCGA 数据库中公开获取的HCC 转录组测序数据和临床资料，对HCC 免疫相关lncRNA 进行了全面的分析，建立HCC 预后免疫相关lncRNA 预后风险模型并进行评估，这将对HCC 管理和治疗策略的制定有很大帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（https://cancergenome.nih.gov）下载HCC 转录组数据和临床资料，下载截止日期到2020年10月9日，临床资料包括：性别、年龄、肿瘤分级，肿瘤病理分期，TNM 分期，生存时间和生存状态，排除生存时间＜30 d、肿瘤病理分级缺失、TNM 分期缺失以及生存信息不详的病例[16]，共下载到376 例HCC 转录组数据和相应的临床资料，根据排除标准，共纳入225 例HCC 样本。

1.2 获取HCC lncRNA表达矩阵

从TCGA 数据库中下载HCC 相对应的metadata和manifest，通过Perl 语言脚本提取HCC 原始counts数据表达矩阵， 从Ensembl 网站（https://asia.ensembl.org/index.html）下载Homo-sapiens.GRCh38.95.chr.gtf.gz 文件，通过Perl 语言脚本对原始counts 数据进行ID 转换得到gene symbol 表达矩阵，再使用Perl 语言脚本提取HCC lncRNA 表达矩阵。

1.3 HCC免疫相关lncRNA的筛选

从GSEA 网站（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp） 获取免疫相关基因集列表（Immune system process M13664，Immune response M19817），从225 例HCC 转录组数据中获得的lncRNA 和免疫相关基因集数据，利用R 语言的“limma”包以共表达分析计算lncRNA 与免疫相关基因的相关性，以相关系数Cor＞0.6 和P＜0.001 筛选HCC 免疫相关lncRNA[17]。

1.4 HCC预后免疫相关lncRNA的筛选及预后风险模型构建

利用Perl 语言脚本将HCC 生存时间和免疫相关lncRNA 表达矩阵进行合并，使用“survival”包进行单因素Cox 回归分析评估免疫相关lncRNA 的预后价值，以P＜0.05 筛选预后相关lncRNA，纳入多因素Cox 回归分析进一步筛选，根据赤池信息量准则（Akaike information criterion，AIC） 确定最佳lncRNA 建立预后风险模型，计算每例样本的风险评分（risk score），计算公式为：所纳入的预后免疫相关lncRNA 的基因表达量乘以多因素Cox 回归系数之和。根据中位风险评分值将HCC 患者分为低风险组和高风险组。

1.5 统计学处理

利用Kaplan-Meier 生存分析法比较低风险组和高风险组患者的生存差异，并绘制预后风险模型的生存曲线，同时采用ROC 曲线下面积AUC 值评估预后风险模型的特异度和敏感度。通过单因素和多因素Cox 回归分析评估HCC 患者风险评分和临床病理信息与总生存期的关系，并绘制森林图，筛选HCC 预后的独立危险因素，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病例特征

本研究共纳入225 例HCC 病例，平均年龄57.03（17～80）岁，性别、年龄、肿瘤分级，肿瘤病理分期和TNM 分期（表1）。

表1 225例HCC患者临床病理特征[n（%）]Table 1 Clinicopathologic characteristics of 225 patients with HCC[n(%)]

2.2 HCC预后免疫相关lncRNA 的筛选

从225 例HCC 转录组数据中获取lncRNA 和免疫相关基因集数据，利用R 语言的“limma”包以共表达分析计算lncRNA 与免疫相关基因的相关性，以相 关系 数Cor＞0.6 和P＜0.001 提 取HCC 免 疫相 关lncRNA 143 个。使用“survival”包进行单因素Cox回归分析筛选出预后免疫相关lncRNA 17 个（均P＜0.05）（表2）。

表2 单因素Cox回归分析筛选HCC预后免疫相关lncRNATable 2 HCC Prognostic immune-related lncRNAs screened by univariateCox regression analysis

2.3 免疫相关的lncRNA 预后风险模型的建立与评估

对于预后免疫相关lncRNA 进一步纳入多因素Cox 回归分析进行筛选，根据最优AIC 值纳入8 个lncRNA 构建预后风险模型（表3），计算每例样本的风险评分（risk score）（图1），根据中位风险评分值将HCC 患者分为低风险组和高风险组（图1）。Kaplan-Meier 生存分析法比较两组患者的生存差异，结果显示，高风险组患者生存率明显低于低风险组患者（P＜0.05），生存曲线显示随着风险评分越高，患者生存率越低（图2）。随后，通过绘制预后风险模型ROC 曲线评价模型的特异度和敏感度，曲线下面积AUC 值为0.774，说明该模型具有良好的效能（图3）。

表3 多因素Cox 回归分析筛选免疫相关lncRNA 构建HCC预后风险模型Table 3 Construction of HCC prognostic risk model using the immune-related lncRNAs screened by multivariate Cox regression analysis

2.4 预后风险模型的临床应用

进一步探索预后风险模型在HCC 患者预后中的应用价值，通过单因素和多因素Cox 回归分析评估HCC 患者风险评分和临床病理信息与总生存期的关系，结果显示，风险评分为HCC 患者预后的独立预测因子，该预后风险模型可以有效预测患者的生存预后（HR=1.608，95%CI=1.351～1.913，P＜0.001）（图4）。

3 讨 论

HCC 是一种高度恶性肿瘤，被列为肿瘤病死率的第三大原因。尽管在HCC 的诊断和治疗方面已取得了巨大进展，但HCC 患者总生存率的提高仍进展缓慢[6,18]。为了寻找新的生物标志物来改善HCC 患者的预后，越来越多学者和研究人员开始关注lncRNA，发现lncRNA 与肿瘤发生发展有关，在HCC 中lncRNA 出现异常表达，并且与肿瘤的生长和患者的预后不良密切相关[19-20]。

过去，研究主要集中在mRNA 和miRNA，对于大多数lncRNA 的功能了解甚少。随着高通量测序数据的快速发展，使得研究学者预测某些转录本的生物学功能的得以实现。对lncRNA 功能的预测也成为研究的热点，同时促进了lncRNA 在肿瘤中的探索。最近有研究[21-22]报道了基于自噬相关lncRNA 的预测模型在HCC 中的应用，并且发现模型对HCC 具有预后判断价值。同时也有学者[23]报道了基于多基因lncRNA 模型在HCC 中的研究，发现lncRNA 模型可良好地预测HCC 患者的生存。此外研究也发现基于免疫相关基因的预测模型也可以有效预测HCC 患者的预后[24]。但是目前尚无免疫相关lncRNA 预后风险模型在HCC 中的研究报道，在本研究中，对TCGA 数据库中HCC 患者的lncRNA 表达谱和相关临床信息进行了全面分析。提取HCC 免疫相关lncRNA 143 个。使用“survival”包进行单因素Cox 回归分析筛选出免疫预后显著相关lncRNA 17 个，Cox 多因素回归分析进一步确定8 个lncRNA 构建预后风险模型，并且根据风险模型计算每位患者的风险评分，将患者分为低风险组和高风险组，高风险组患者生存率显著低于低风险组患者，用于预测HCC 患者生存率的风险评分模型的ROC 曲线下面积AUC 达到0.75 以上，表明在生存预测方面具有良好的特异度和敏感度。此外，单变量和多变量Cox 回归分析表明，风险评分为HCC 患者预后的独立预测因子，证明该预后风险模型可用于预测HCC 患者的预后。在8 个lncRNA 中 AL139384.1、 DANCR、 AC124798.1 和AC023157.3为危险基因， MAPKAPK5-AS1、LINC02362、SLC25A30-AS1 和LINC02499为保护基因。研究[21,25-26]发现DANCR 在HCC 中出现高表达与肿瘤发生显著相关，并且与HCC 预后显著相关。此外，在结直肠癌中发现MAPKAPK5-AS1 在肿瘤组织中显著高表达，敲除MAPKAPK5-AS1 可以显著抑制结直肠癌细胞增殖并引起细胞凋亡。MAPKAPK5-AS1 可作为结直肠癌新型的预后生物标志物[27-28]。同样有研究[29-30]报道LINC02499 为HCC的保护基因，可能是潜在的HCC 诊断和预后生物标志物，并可能在HCC 的发生发展中发挥抑癌作用。而另外5 个lncRNA 目前尚无相关研究报道，仍有待进一步研究。

综上所述，基于TCGA 数据HCC lncRNA 表达谱的全面分析，最终确定了8 个预后免疫相关lncRNA 构建的预后风险模型，可以有效预测HCC患者预后和危险分层的分子标志物，可作为其独立的预后生物标志物。但本研究存在一定的局限性，包括缺乏多中心数据库的验证，目前8 个lncRNA 在HCC 中分子作用机制和相关信号通路尚不清楚等，仍需进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。