类芽孢杆菌ZX-5产胞外多糖的发酵条件优化及其保湿特性

杨棒棒，符运会，周佳，屈建航，罗宇，李海峰，孙静怡，张鑫

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

多糖作为新型天然产物，越来越受到人们关注。自然界中多糖主要从植物和微生物中提取，其中微生物具有生长周期短、条件易控、多糖易与菌体分离、提取精制容易且不受季节因素和病虫害影响等优点，在工业化生产方面具有广阔的发展前景[1]。

胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一种高分子水溶性物质，从表观形态上分为荚膜多糖和粘液多糖[2]。胞外多糖具有抗氧化性[3]、抗肿瘤[4]、免疫调节[5]等活性，也可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂等食品添加剂运用到食品生产和生活中[6]。目前报道产胞外多糖的微生物有细菌、真菌和放线菌，细菌中已有报道明串珠菌属（Leuconostoc）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等，类芽孢杆菌也有报道。Gao等[7]从西藏牦牛奶中分离得到一株类芽孢杆菌，经鉴定该菌是一个新种，所产生的EPS可增强免疫活性[8]。戴德慧等[9]用不同浓度的类芽孢杆菌胞外多糖喂养小鼠，并进行急性经口毒性试验、骨髓细胞染色体畸变等实验，表明小鼠的最大粘多糖耐受剂量为 12 g/kg，该粘多糖为无毒物质。Sun等[10]利用Paenibacillussp.产的EPS，在相对湿度为43%和 81%的条件下，吸湿率接近于透明质酸，这些特性使EPS成为化妆品行业中较昂贵的透明质酸的良好替代品。保湿作用是护肤品行业最重要的性能之一，在护肤品中添加一定比例的保湿剂，既可减少产品水分的散失，又可和表皮水分进行水合，从而起到保湿增湿作用[11]。虽然微生物胞外多糖具有巨大的优势，但产胞外多糖菌株的开发及其发酵工艺条件的研究，仍是当前该领域研究的前提和关键。本研究通过对实验室分离的一株类芽孢杆菌EPS的研究，获得该菌的最佳发酵条件和EPS保湿性能，以提高EPS的产量，并为提升对天然微生物多糖的认识及应用开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

实验室自湖泊沉积物中分离的一株产胞外多糖细菌菌株ZX-5。

1.1.2 培养基

蛋白胨酵母膏培养基（每L）：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，酵母粉3 g，氯化钠5 g，Na2HPO4·12H2O 2.50 g，pH 5；固体培养基加入琼脂粉13.50 g。115 ℃条件下，灭菌30 min。

基础产糖培养基（每L）：蔗糖30 g，酵母粉3 g，K2HPO4·3H2O 3 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，pH 5。115 ℃条件下，灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉等，购于生工生物工程（上海）股份有限公司；浓硫酸、HCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O，购于阿拉丁试剂（上海）有限公司。试剂均为国产分析纯。其中5%苯酚配制方法为：称取5 g苯酚加入蒸馏水加热溶解，冷却后100 mL容量瓶定容。

1.3 方法

1.3.1 16S rRNA基因测序及系统发育树构建

利用细菌E. coli通用引物PCR扩增16S rRNA基因。PCR产物进行电泳检测及核苷酸序列测定，GenBank数据库BLAST比对并下载相似序列，使用MEGA 7.0软件构建系统发育树，鉴定菌株的系统分类地位[7]。

1.3.2 胞外多糖的提取

将ZX-5菌种接种到蛋白胨酵母膏固体培养基，28 ℃培养19 h，接入蛋白胨酵母膏液体培养基进行摇瓶培养，温度28 ℃，转速150 r/min，21 h后形成种子液，以5%（V/V）的接种量接至基础产糖培养基。

按照贾玉香[4]等人的方法，稍作修改，将上述发酵液在4 ℃、10000 r/min离心15 min，收集上清液；通过旋转蒸发仪55 ℃浓缩至1/5；向上清液加入4倍体积无水乙醇，4 ℃静置过夜，离心15 min，收集沉淀，并用适量蒸馏水溶解；液体中加入 1/4体积比sevage试剂（氯仿:正丁醇=4:1），室温下置于摇床振荡30 min，然后8 000 r/min离心10 min，保留水相。重复多次，直至蛋白完全除去，冻干保存。

1.3.3 胞外多糖的测定采用硫酸-苯酚法[12]测定ZX-5胞外多糖含量。测试并绘制葡萄糖标准曲线[13]，得到线性回归方程：Υ=0.0047Χ+0.041，R2=0.994

一次改变一个独立变量，同时保持其他因素在固定水平（初始pH 5，装液量100 mL/250 mL，接种量5%，温度28 ℃，转速150 r/min，初始培养基为基础产糖培养基）。选取3%水平的不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖）、0.3%水平的不同氮源（蛋白胨、酵母浸粉、硝酸钠、尿素），以及不同培养条件即初始 pH（5.50、6、6.50、7 和 7.50）、培养温度（10 ℃、20 ℃、28 ℃、35 ℃、40 ℃）进行单因素实验。培养20 h，测定胞外多糖产量。

1.3.5 响应面实验设计

在单因素试验基础上，运用Box Behnken的中心组合设计原理，选取蔗糖浓度、温度和硝酸钠浓度作为自变量，细菌胞外多糖产量作为响应值，设计3因素3水平试验进行响应面分析，如表1所示，从而获得菌株高产胞外多糖的最佳培养条件。

表1 响应面试验的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.6 方差分析

使用IBM SPSS Statistics 26统计软件对单因素优化实验结果进行单因素方差分析，通过F检验确定其显著性，并以p值表示，以确定对ZX-5产胞外多糖影响显著的因素。

1.3.7 多糖保湿性测定

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参照鲁铁等[14]实验方法，称取ZX-5胞外多糖、甘油、壳聚糖的干燥样品各0.20 g，置于培养皿中，向培养皿中分别加入5 g的蒸馏水将样品完全均匀地湿润，置于干燥器中（硅胶干燥剂环境），放入25 ℃恒温箱中，定时称量样品的重量。水分残存率为放置后样品中水分的质量比放置前样品中水分的质量。实验设置平行重复。

1.3.8 数据处理

实验均设置3组平行，数据采用Origin软件作图，结果以平均值±标准差表示。在“响应面方法”中，使用Design Exper（t版本11.1.0.1, Stat-Ease Inc., Minneapolis,MN, USA）统计软件进行回归分析。多项式模型方程的拟合质量由确定系数R2表示，其统计显著性通过F检验来确定。每个回归系数的显著性水平由t检验确定，显著性水平以p值给出。

2 结果与分析

2.1 基于16S rRNA的系统发育树分析

通过对菌株ZX-5的16S rRNA基因核苷酸序列测定，完成GenBank的BLAST同源性比对，并下载相似序列，构建系统发育树（图 1）。经鉴定，ZX-5是一株类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）。

2.2 单因素结果分析

2.2.1 碳源对ZX-5产胞外多糖的影响

碳源优化结果如图2a，不同碳源之间对多糖产量具有显著性差异（p<0.05），蔗糖为碳源时，菌株ZX-5的胞外多糖产量最大，为18.03 g/L。据报道细菌产胞外多糖的最适碳源多为蔗糖[15]，如周璇等[16]在敦煌地区筛选的地衣芽孢杆菌Ⅱ4-01，25 g/L蔗糖为碳源，胞外多糖产量最大达8.59 g/L，王波等[17]对多粘类芽孢杆菌菌株XZ-2的培养基配方及发酵培养条件进行了优化研究，表明蔗糖15 g/L为最佳碳源；大多数类芽孢杆菌利用蔗糖发酵产糖量较高[18]。菌株ZX-5以可溶性淀粉作为碳源时，由于淀粉本身是多糖，在发酵过程中可能菌体产胞外多糖量没有消耗的淀粉量大，因此测得的产糖量结果是负值。蔗糖浓度优化结果如图2b，当蔗糖浓度为200 g/L时，胞外多糖产量最大为37.59 g/L，蔗糖浓度进一步增大，多糖产量反而减少，可能是蔗糖浓度过高，外界渗透压较大，不利于菌株生长和产胞外多糖。

2.2.2 氮源对ZX-5胞外多糖产量的影响

测定不同氮源培养液中ZX-5的产糖量，结果如图3所示，ZX-5发酵产糖过程中对硝酸钠、酵母浸粉和尿素的利用率较高，但对蛋白胨利用率较低。以蛋白胨为氮源时，多糖产量仅为1.20 g/L，而以硝酸钠为氮源时，产糖量最高，为17.18 g/L，表明该菌对速效氮源的利用率更高。在硝酸钠浓度3 g/L时，菌株产胞外多糖量达到最大 13.90 g/L，与其它组有显著性差异（p<0.05），氮源浓度过低，ZX-5生长所需氮源成为限制因素，影响其生长繁殖和合成胞外多糖，浓度过高，碳氮比值变小，生长环境不适宜，同样会产生负面影响。因此，初步确定最适氮源浓度为3 g/L硝酸钠。

2.2.3 温度、pH对ZX-5胞外多糖产量的影响

不同培养温度下ZX-5产糖量如图4a所示，20 ℃时产糖量最大。随着培养温度的降低，胞外多糖的产量逐渐增加，与Bruno等[19]研究结果一致，可能该菌胞外多糖能够保护菌株生长繁殖，温度过低时，影响体内相关酶的活性，产糖量进而减小。不同温度间存在显著性差异，表明温度是产糖量的主要影响因素之一。不同pH对微生物生长代谢影响很大，孙红斌[20]等人研究发现，发酵液的初始pH值对多糖产量有较大影响，pH过高或过低均会影响菌株的生长繁殖，进而影响多糖产量，本研究也印证了这一点，如图 4b所示，当pH增加到7.50或者降低为5.50时，两组数据没有显著性差异，但胞外多糖产量下降明显，pH为6时，EPS产量达到最大值23.12 g/L，差异为极显著水平（p<0.01），因此选择培养基初始pH值为6。

2.3 方差分析

在单因素实验优化基础上，进行方差分析来确定各因素对ZX-5胞外多糖产量影响的大小。方差分析结果如表2所示。

根据表2结果可以得出：硝酸钠浓度、蔗糖浓度、初始 pH、发酵温度的p<0.01，说明硝酸钠浓度、蔗糖浓度、初始pH、发酵温度均对ZX-5产胞外多糖量产生极显著影响，初始pH影响菌的生存能力，间接影响胞外多糖的产量，因此不适宜做响应面的优化指标，最终选择硝酸钠浓度、蔗糖浓度、发酵温度这三个影响因素。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

表3 Box Behnken试验设计与结果Table 3 Response surface test design and results

2.4 多因素结果分析

进行3因素3水平的响应面实验，共17组实验。表3为实验设计与结果。

2.5 响应面分析

对实验数据进行多元回归拟合，得到二次方程为：

式中：

Y——胞外多糖产量，g/L；

A——蔗糖浓度，g/L；

B——温度，℃；

C——硝酸钠浓度，g/L。

对二次模型进行方差分析，从中可以看出（表4），模型F值为127.93，具有显著性。p值小于0.05表示模型项具有显著性，p值小于0.01表示模型项具有极显著性，同样的，A、B、C、AB、BC、A²、C²、和B2均具有极显著性。失拟项F值为43.64，p值大于0.05，意味着失拟项相对于纯误差不显著。决定系数R2=0.99>90%，说明EPS产量的试验值与模型回归数值有良好的一致性。模型的校正系数 R2Adj=0.98，说明该模型能够解释相应值变化的98%，模型拟合度较好，预测值与实测值有较好的相关性，可用于对ZX-5胞外多糖发酵生产进行分析和预测。

三个因素（温度、硝酸钠浓度和蔗糖浓度）对ZX-5胞外多糖产量的交互作用，可以由响应面图和等高线图直观地看出，由图 5（a）和（d）可看出，温度和蔗糖浓度增大或减小，胞外多糖产量也随之变化，二者之间存在交互作用故变化趋势不同，图的颜色的变化表示多糖产量从少到多的变化，变化的越快，表示坡度越大，即对试验结果的影响更为显著。图5（b）和（e）是硝酸钠浓度和蔗糖浓度对ZX-5胞外多糖产量影响的响应面及等高线图，图 5（c）和（f）是硝酸钠浓度和温度对ZX-5胞外多糖产量影响的响应面及等高线图。

表4 二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variance in quadratic model

2.6 多糖最优条件验证

通过单因素和响应面实验分析，得到最佳产糖条件为：蔗糖200 g/L，硝酸钠3 g/L，温度20 ℃，其它条 件 为 K2HPO4·3H2O 3 g/L ，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，pH 6，转速 150 r/min，21 h，预测产糖量为35.48 g/L。根据最佳培养方案，进行三组平行实验，实验结果平均值为34.55 g/L，与预测结果接近。

2.7 多糖的保湿性

胞外多糖作为天然物质具有一定的湿度，可应用于食品工业及化妆品工业中。本研究表明（图6），干燥环境中，ZX-5胞外多糖在 38 h的水分残留率为50%，保湿性略优于壳聚糖和甘油。Li等[12]研究一株假单胞菌PGM37的胞外多糖，发现其保湿能力优于甘油，但次于透明质酸，在化妆品和临床医学领域具有潜在应用价值。Chao等[21]研究发现蔗糖酯和玉竹多糖混合可调节水分结合能力，并提高多孔碳水化合物基质的保湿和防潮性能。Yong等[22]研究发现Phyllobacteriumsp.产生的EPS是一种新型多糖，具有良好的流变性和优异的保水能力。本研究中 ZX-5菌株的胞外多糖易溶于水，具有良好的保水能力，在32 h时，水分残留率优于壳聚糖6%，在37 h水分残留率优于甘油7.52%，并且在70 h之前，保湿能力一直大于甘油和壳聚糖。因此ZX-5胞外多糖可作为天然物质保持一定的湿度，具有应用于食品工业或化妆品工业的保湿潜力。

3 结论

3.1 本研究对分离自湖泊沉积物的一株产胞外多糖的细菌菌株，通过单因素和响应面实验分析，得到最佳产糖条件为：初始蔗糖浓度200 g/L、硝酸钠3 g/L、K2HPO4·3H2O 3 g/L、KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，pH 6，发酵温度20 ℃。该最优条件下菌株摇瓶发酵的胞外多糖产量为34.55 g/L，是基础水平17.15 g/L的2.01倍，产糖量提升比较明显。本研究类芽孢杆菌ZX-5的多糖产量，在目前相关报道中处于前列。

3.2 目前的保湿剂主要为多元醇类、甘油、透明质酸及其钠盐等品种，近年来研究者在拓宽传统保湿剂的应用和开发新型保湿剂方面做了许多工作，尤其以多糖类物质为主。本研究所得到的类芽孢杆菌ZX-5所产胞外多糖在56 h前保湿性一直优于甘油和壳聚糖，在38 h其水分残留率仍为50%，具有较长时效的保湿性能，在食品和化妆品等水分保持应用中，具有一定的潜力和价值，有待于进一步开发。