超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定阳荷花苞中的化学成分

罗梦兰，任廷远，殷明月，董令，郑启健，谢姣*

（1.贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室公共卫生学院，贵州贵阳 550025）

（2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025）

阳荷（Zingiber miogaRoscoe），又名野姜、山姜、猴姜等，属姜科姜属多年生草本植物，是一种药食同源的膳食纤维蔬菜[1,2]。其中，阳荷食用部位花苞，是由阳荷地下根茎发育而长出地面，主要呈紫红色松果状[3]。近年来，随着国民经济的增长以及人们对营养健康的认识逐渐加深，成熟阳荷花苞不仅因其鲜艳的色泽及独特的辛香气味，还因这种抗逆性强、适用性广且基本无病虫害并含多种营养物质如糖类、有机酸、氨基酸、脂类等代谢产物逐渐受到人们的关注[4-9]。

近年来，有关阳荷的研究主要以野生型为主，对阳荷花苞中化学成分的研究已见蛋白质、氨基酸、粗脂肪、粗纤维、总糖、可滴定酸、黄酮化合物、多糖类、红色素、皂苷类、生物碱、维生素C等营养成分的报道[4-14]；另外，galanal A、galanal B、miogadial已证实为阳荷特征成分[1,3,7]。阳荷花苞主要以鲜食为主[10]，而探索影响其鲜食风味品质的相关研究将为正确理解其鲜食风味形成提供重要的理论依据，目前影响阳荷花苞鲜食风味品质的相关研究未见报道。据报道糖类和有机酸是影响阳荷鲜食口感的2种最重要的指标，糖类可作为合成其他物质过程的重要单体[11,12]，是合成氨基酸、有机酸、脂类等营养成分的基础[13]。然而近年来对阳荷中糖类的研究主要集中在部分糖类如蔗糖、果糖、葡萄糖的定性与定量上[4,14,15]，并未对阳荷中存在的其他糖类进行鉴定和分析。另外，近年来对阳荷中有机酸的研究主要关注在部分氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等的鉴定上[5,14]，并未涉及其他有机酸种类。研究Li等[16]绘制的整体代谢网络图发现，三羧酸循环是部分氨基酸如谷氨酸、精氨酸和丙氨酸合成的上游物质。此外，三羧酸循环作为重要的循环过程，可连接糖酵解、氨基酸及脂肪酸生物合成途径[17,18]。因此，研究影响阳荷鲜食风味的有机酸种类不仅仅局限于氨基酸，还应包括三羧酸循环在内的其他有机酸。此外，据报道氨基酸对风味品质的形成具有重要影响[16]，且氨基酸的代谢沟通脂肪酸的生物合成。而脂肪酸是构成脂类的重要成分，由饱和脂肪酸和不饱和脂肪组成。目前，对阳荷中脂类的研究仅有粗脂肪的分析[15]，而对阳荷中脂肪酸种类的定性及定量研究还未见相关报道。

因此，本研究以阳荷花苞为研究对象，通过代谢产物常用检测方法UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS（超高效液相色谱-电喷雾离子源-三重四极杆-线性离子阱质谱，简称超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法）[19]，系统分析阳荷中化学成分糖类、有机酸、氨基酸和脂肪酸的种类和相对含量。而目前作为药食两用的蔬菜风味品质研究仅有植物乳杆菌发酵对生姜氨基酸的变化研究[20]，故研究阳荷鲜食风味品质形成相关化合物即糖类、有机酸、氨基酸和脂肪酸种类和含量，不仅将为研究其他药食两用蔬菜的鲜食风味品质形成提供思路，同时也为阳荷作为鲜切蔬菜的质量控制、开发与利用提供相应化学成分层面基础数据的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验样品为花期50 d左右的阳荷花苞，采自贵州省黔东南苗族侗族自治州从江县，挑选无机械损伤、无病虫害、大小均匀一致的健康花苞，于室温下洗净，晾干后立即液氮冷冻后，存于-80 ℃冰箱备用。

甲醇，色谱纯，德国默克公司；乙腈，色谱纯，德国默克公司；表2中化合物对应标准品，色谱纯，BioBioPha/WAKO/Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Scientz-100F冻干机新芝生物有限公司；MM400，Retsch研磨仪德国莱驰公司；UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS（UPLC，SHIMADZU Nexera X2，日本岛津公司；MS/MS，Applied Biosystems 4500 QTRAP，美国Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS样品制备

样品制备参考Chen等[21]方法并加以修改，经冻干机真空冷冻干燥后的样品于研磨仪（30 Hz，1.5 min）作用下研磨至粉末状；称取以上粉末状样品100 mg，溶于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每30 min涡旋30 s，共6次，其后样品置于4 ℃冰箱放置12 h；其后样品于12000 r/min离心10 min后，用0.22 μm微孔滤膜过滤上清液，并保存于进样瓶中，供 UPLC-MS/MS分析，实验重复3次。

1.3.2 UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS条件

使用UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS系统分析1.2.1所制备的样品。分析条件如下：

1.3.2.1 UPLC条件

色谱柱为安捷伦SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.35 mL/min，柱温40 ℃，进样量为4 μL，其中流动相A相，超纯水（添0.1%甲酸）；流动相B相，乙腈（添0.1%甲酸），样品测量采用梯度洗脱。

表1 阳荷中化学成分的流动相梯度Table 1 Flow phase gradient for chemical component in Zingiber mioga Roscoe

1.3.2.2 ESI-Q TRAP-MS/MS条件

AB4500QTRAP UPLC/MS/MS系统配置有LIT和三重四极（QQQ）扫描，该系统配备了ESI涡轮离子喷雾接口，由Analyst 1.6.3软件（ABSciex）控制运行正负2种离子模式，其中ESI源运行参数为：电喷雾离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和帘气（CUR）分别设置为50、60和25.0 psi；碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下，分别用10和100 μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM（多反应检测模式）模式，碰撞气体（氮气）设置为中等。优化DP（射入电压）和CE（碰撞电压），完成各个MRM离子对的DP和CE参数确定。通过每个时期洗脱的代谢物，检测每个时期其中一组特定的MRM离子对。

1.3.3 阳荷花苞化学成分的定性

根据二级谱信息以及化学成分标准品进行物质定性，分析时去除同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复信号以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。阳荷花苞中化学成分是利用三重四级杆质谱的MRM分析完成，MRM模式中，四级杆首先筛选目标物质的母离子，排除其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰，其后母离子经碰撞室诱导电离后断裂形成碎片离子，再通过三重四级杆过滤选出所需的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰。利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，采用峰面积归一化法测定各化学成分的相对百分含量。

1.4 数据分析与处理

使用Graphpad Prism 7.0和Photoshop软件绘图，使用Graphpad Prism 7.0进行数据统计。

2 结果与分析

2.1 阳荷花苞中化学成分的鉴定

阳荷花苞化学成分用UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS分析，根据质谱图参数同数据库母离子分子量、特征碎片离子、DP、CE以及标准品核对进行化学成分的鉴定；其中样品总离子流图（Total ions current，TIC）及MRM代谢物检测多峰图，如图1所示。表2～表5结果显示，试验共鉴定了105个化学成分，其中包括了16个糖类、39个有机酸、25个氨基酸和25个脂肪酸。

2.2 阳荷花苞中糖类组分及相对含量分析

如表2所示，对阳荷花苞化学成分中糖类组分进行鉴定分析，共发现16个糖类包括单糖、双糖及其他糖类等。利用面积归一法对这16个组分进行相对定量分析，结果发现相对含量较高的糖类为单糖类如 D-葡萄糖、D-果糖等，其相对含量占鉴定的 16个糖类的 79.73%，而其相对含量依次为含 2.97%的 D-葡萄糖、2.95%的D-果糖等；其次为其他糖类如葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6磷酸、D-景天庚酮糖7-磷酸等，双糖类如D-蔗糖、麦芽糖、乳二糖等。以上鉴定到的阳荷单糖即D-葡萄糖、D-果糖以及双糖如蔗糖同梁帅等[4]研究中提取的阳荷多糖组分结果一致，但梁帅等[4]提取的多糖中含量最高的是蔗糖，这和结果中鉴定到的糖类含量最高的D-葡萄糖结果不一致，这可能是产地等差异引起含糖量高低顺序不一致的原因。

表2 UPLC-ESI-MS/MS鉴定的阳荷花苞糖类分析结果Table 2 Identification of the sugar components in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

表3 UPLC-ESI-MS/MS鉴定阳荷花苞有机酸分析结果Table 3 Identification of the organic acids in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

表4 UPLC-ESI-MS/MS鉴定阳荷花苞氨基酸分析结果Table 4 Identification of the amino acids in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

2.3 阳荷花苞中有机酸组分及相对含量分析

如表3所示，对阳荷花苞中化学成分有机酸组分进行鉴定分析，共发现39个有机酸，包括三羧酸循环所涉及的有机酸及其衍生物等。利用面积归一法对这39个组分进行相对定量分析，结果发现相对含量较高为三羧酸循环过程所涉及的有机酸，如含 8.15%异琥珀酸、7.82%琥珀酸、7.80% L-苹果酸、3.08%异柠檬酸、1.54%柠檬酸等，其相对含量占鉴定的39个有机酸的75.86%，其次为其他有机酸如壬二酸、奎宁酸、D-木糖酸、焦酒石酸、戊二酸等。其中，以上结果中阳荷的鉴定中含有机酸类物质，同样地朱仁威等[15]研究发现铜仁阳荷中可滴定酸含量达0.26%，表示其含有机酸类（包括柠檬酸），说明阳荷花苞中含有机酸物质与朱仁威等[15]研究结果一致。

2.4 阳荷花苞中氨基酸组分及相对含量分析

如表4所示，对阳荷中化学成分氨基酸进行鉴定分析，共发现25个氨基酸，包括9个必需氨基酸（即必需氨基酸指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸，主要包括8种必需氨基酸加1种婴儿必需氨基酸即组氨酸）和16个非必需氨基酸等，其中本研究中阳荷花苞的必需氨基酸种类较朱仁威等[15]研究铜仁阳荷结果中必需氨基酸多1种即色氨酸。利用面积归一法对25个氨基酸进行相对定量，结果发现其含量较高的为必需氨基酸，如L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸，其相对含量占以上定性氨基酸的53.56%，其次为其他非必需氨基酸如L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-正亮氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸等。以上结果中阳荷花苞鉴定到氨基酸种类（25个）较其他研究多（≤18个），如朱仁威等[15]研究铜仁阳荷花苞氨基酸种类为17种，张成程等[5]研究来凤县阳荷氨基酸种类为18种；此外，本试验含量最高的为必需氨基酸，这同张成程等[5]研究阳荷中非必需氨基酸含量高于必需氨基酸的结果不一致，这可能是样品产地不同所致，同时非必需氨基酸中含量最高的是精氨酸，这与张成程等[5]研究结果一致。与药食两用蔬菜生姜相比[20,22,23]，阳荷花苞中L-谷氨酰胺、高精氨酸、环亮氨酸、L-酵母氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-瓜氨酸、L-高胱氨酸、L-高瓜氨酸、L-别异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-色氨酸为其特有氨基酸，其中L-色氨酸为必需氨基酸，L-瓜氨酸是一种具有极其重要的生理功能的非蛋白质氨基酸[24]。

2.5 阳荷花苞中脂肪酸组分及相对含量分析

如表5所示，对阳荷中化学成分脂肪酸组分进行鉴定分析，共发现25个脂肪酸，包括3个饱和脂肪酸和22个非饱和脂肪酸。利用面积归一法对这25个组分进行相对定量分析，结果发现相对含量较高的为非饱和脂肪酸（包括必需脂肪酸即亚油酸和α-亚麻酸），如γ-亚麻酸、9,10,13-三羟基-11-十八碳烯酸、亚油酸、反油酸、α-亚麻酸等，其相对含量占定性脂肪酸的70.00%，其次为3个饱和脂肪酸如硬脂酸、肉豆蔻酸和十一烷酸，其中本研究鉴定的亚油酸、γ-亚麻酸和α-亚麻酸和与严小红等[25]研究结果中亚油酸和亚麻酸是姜科属常见成分的结论一致。

表5 UPLC-ESI-MS/MS鉴定阳荷花苞脂肪酸分析结果Table 5 Identification of the fatty acids in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

3 结论

本研究利用 UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS分析阳荷化学成分，结果显示阳荷花苞中共鉴定了包括糖类、有机酸、氨基酸和脂肪酸在内的4类共105个化学成分。其中，糖类组分共鉴定了16个，利用面积归一法对其进行相对定量，含量最高的为单糖类，依次为D-葡萄糖、D-果糖、D-阿拉伯糖等，其次为其他糖类和双糖类；共鉴定了39个有机酸组分，而三羧酸循环过程所涉及的有机酸如异琥珀酸、琥珀酸、L-苹果酸、异柠檬酸、柠檬酸等相对含量最高，其次为其他有机酸如壬二酸、奎宁酸、D-木糖酸等；共发现 25个氨基酸，其中9个必需氨基酸（含组氨酸）相对含量较16个非必需氨基酸高；共鉴定了25个脂肪酸，其中22个脂肪酸为非饱和脂肪酸（包含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸），其相对含量高于饱和脂肪酸。综上，与药食两用蔬菜生姜相比，阳荷花苞中特有氨基酸为L-谷氨酰胺、高精氨酸、环亮氨酸、L-瓜氨酸、L-色氨酸等12种，其中包括了必需氨基酸L-色氨酸及活性氨基酸L-瓜氨酸。本研究首次系统揭示了阳荷中化学成分糖类、有机酸、氨基酸和脂肪酸组成，其中包含了人体所需的9种必需氨基酸和2种必需脂肪酸，这为人们正确认识阳荷的营养价值提供参考，并为阳荷鲜食风味形成理论奠定基础。