新型多金属氧酸盐药物{BiW8O30}对肝癌SK-HEP-1细胞的抑制作用

祝欣萍，贾 迪，林少辉，刘 晨，李婧铱，赵炜明，2，*

(1．齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

肝癌是源于肝细胞和肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤。据2020年全球癌症统计数据分析，全世界每年约有90.5万例肝癌新发病例和83万例肝癌引起的死亡病例[1-2]。手术切除、肝移植、局部消融、化学治疗是肝癌患者的主要治疗方式[3]。索拉菲尼、阿霉素、顺铂等药物作为临床治疗肝癌常见的化疗药物[4]，长期使用可产生严重毒副作用并可引起肿瘤耐药[5]。因此，探寻新型低毒、高效的抗癌药物具有重要意义。

多金属氧酸盐(polyoxometalates，POMs)是由前过渡金属离子通过氧连接而形成的一类多金属氧簇化合物[6]。POMs药物具有低毒性、高活性的特点，能显著抑制肿瘤生长和血管生成[7]，是抗癌治疗的潜在候选药物。多项研究表明[8-11]，POMs药物对包括胰腺癌、白血病、肝细胞癌、结肠癌、卵巢癌和胃癌在内的多种肿瘤均有治疗作用。2020年，Razavi等[7]合成的高负电荷Preysler POM负载纳米脂质体可抑制人肝癌HepG2细胞的生长并促进细胞凋亡。同年，Joshi等[12]合成了一种新型的多钼酸盐基有机-无机杂化固体并通过诱导MCF-7、A549和HepG2细胞的凋亡和坏死途径最终导致癌细胞死亡。2021年，孙宏斌等[13]发现多金属氧酸盐SbW9能抑制非小细胞肺癌细胞系A549和PC9的增殖并诱导其凋亡。

{BiW8O30}是通过新型有机配体及非贵金属杂原子修饰的多金属氧酸盐药物，分子式为Na6H4[Bi2W20Co2O70(H2O)6]·34H2O。通过综合运用细胞生物学、分子生物学和生物信息学技术，本研究团队发现了{BiW8O30}具有激活肉瘤细胞焦亡、上调活性氧水平、抑制DNA修复等多重作用[14]。但尚未有研究者将{BiW8O30}应用于肝癌中，故本研究以肝癌SK-HEP-1细胞为研究对象，探讨{BiW8O30}对体外培养的肝癌细胞增殖、集落形成、迁移、侵袭及凋亡的作用，为肝癌治疗药物的研发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人肝癌细胞系SK-HEP-1购于中国科学院细胞库，RPMI-1640培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于BI公司；胰酶细胞消化液、青-链霉素混合液购于碧云天公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购于BioFroxx公司；CCK-8试剂盒购于SEVEN公司，Transwell小室与孔板均购于BioFil公司；Matrigel基质胶(356234)购于Corning公司；DAPI和Annexin VAlexa Fluor488/PI细胞凋亡检测试剂盒购于四正柏生物；多金属氧酸盐药物{BiW8O30}由哈尔滨理工大学宫丽阁课题组提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SK-HEP-1细胞采用含10%胎牛血清和1%双抗的1640培养液，培养于37℃、CO2体积分数5%、饱和湿度的培养箱中。每2~3 d换液1次；待细胞生长至汇合度达70%~80%时按1∶3的比例传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 {BiW8O30}溶液配制 精确称取{BiW8O30}药物0.012 4 g，溶于5 mL细胞培养基(超声破碎仪使药物完全溶解)，0.22μm的滤膜过滤即为400μmol/L的无菌母液。使用时用细胞培养基稀释至不同处理浓度。

1.2.3 细胞增殖实验 常规消化SK-HEP-1细胞并调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔板并铺匀，于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中孵育过夜。待细胞贴壁且生长汇合度为70%~80%时，设置4个不同浓度的实验组，分别在培养基中加入终浓度为50、100、200、400μmol/L的{BiW8O30}溶液，对照组采用不含受试药物的培养基，分别培养24和48 h。终止培养后，加入10μL的CCK-8指示剂，孵育2 h后于450 nm处测定吸光度值D(450)，并计算细胞存活率和半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。IC50通过GraphPad Prism进行计算。

1.2.4 细胞集落形成实验 SK-HEP-1细胞常规消化后按500个/mL的浓度接种于6孔板并孵育过夜。待细胞贴壁，设置3个不同浓度的实验组，分别在培养基中加入终浓度为50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，对照组采用不含受试药物的培养基，连续培养2周。待6孔板中有明显的细胞集落形成，进行染色、拍照。通过ImageJ计数集落形成数。

1.2.5 细胞划痕实验 SK-HEP-1细胞以5×105个/mL的浓度均匀接种于6孔板并孵育过夜。待细胞贴壁且生长汇合度达90%以上，用10μL枪头末端在6孔板中央划痕，PBS清洗2次。设置3个不同浓度的实验组，分别在培养基中加入终浓度为50、100、200 μmol/L的{BiW8O30}溶液，对照组采用不含受试药物的培养基继续培养。于划痕后0、24、48 h在同一位置进行拍照。通过ImageJ测量划痕愈合面积S。

1.2.6 Transwell实验 Matrigel基质胶与无血清培养基按照1∶8的比例稀释混匀，取45μL均匀铺到Transwell小室中孵育过夜。待胶凝固，常规消化SKHEP-1并调整细胞浓度为5×105个/mL，设置3个不同浓度的实验组，分别在培养基中加入终浓度为50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，对照组采用不含受试药物的培养基。200μL细胞悬液接种于上室，600μL含10%血清的培养基加入下室，分别培养24和48 h。培养终止后，弃掉培养基，棉签擦掉上室未穿膜的细胞，甲醇固定60 min，0.1%的结晶紫染色8 min，PBS淋洗2次，镜下随机选取5个视野进行拍照计数，观察细胞侵袭情况。通过ImageJ计数侵袭细 胞数。

1.2.7 DAPI染色 常规消化SK-HEP-1并调整细胞浓度为1×106个/mL，均匀铺到6孔板中并孵育过夜。待细胞贴壁，设置3个不同浓度的实验组，分别在培养基中加入终浓度为50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，对照组采用不含受试药物的培养基，培养24 h。然后PBS清洗2次，4%多聚甲醛-20℃固定15 min，PBS冲洗2次，室温避光染色10 min，PBS冲洗后，于荧光倒置显微镜下观察拍照。

1.2.8 DAPI/Annexin V-Alexa Fluor488/PI荧光染色 SK-HEP-1细胞以1×105个/mL的细胞浓度均匀接种于6孔板并孵育过夜。待细胞贴壁，设置3个不同浓度的实验组，分别在培养基中加入终浓度为50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，对照组采用不含受试药物的培养基，培养24 h。完成凋亡刺激后，预冷PBS洗涤两次，1 000 r/min离心5 min，200μL的Binding Buffer重悬。依次加入DAPI、Annexin V和PI，室温避光反应30 min，滴1滴反应液于载玻片上，荧光显微镜下观察荧光信号。

1.3 统计学方法

本研究所有实验均重复3次及以上，数据均采用±s表示。统计分析软件包括ImageJ、GraphPad Prism，组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)进行统计分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1细胞的体外增殖能力

细胞增殖实验结果见图1，{BiW8O30}作用SKHEP-1细胞24和48 h的IC50分别为(102.07±1.38)、(74.68±0.91)μmol/L。与 对 照组相比，50、100、200、400μmol/L的{BiW8O30}处理24 h后，SK-HEP-1细胞存活率分别降低了29.98%、51.29%、65.81%、83.59%；48 h后SK-HEP-1细胞存活率分别降低了31.57%、66.23%、81.88%、83.97%，差异具有统计学意义(P＜0.01)。以上结果表明{BiW8O30}显著抑制人肝癌SK-HEP-1细胞的体外增殖能力。

图1 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1细胞的体外增殖能力

2.2 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1细胞的集落形成能力

细胞集落形成实验结果见图2，与对照组相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}处理后，SK-HEP-1细胞的集落形成数显著减少，分别降低了28.57%、63.27%、90.82%，表明{BiW8O30}对SK-HEP-1细胞的集落形成能力具有显著的抑制作用。

2.3 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1细胞的迁移和侵袭能力

划痕实验结果见图3，与对照组相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}处理24 h后，SK-HEP-1细胞的划痕愈合率降低了8.47%、70.59%、80.83%；48 h后，SK-HEP-1细胞的划痕愈合率降低了19.56%、65.98%、75.49%。Transwell实验结果见图4，与对照组相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}处理后，24 h内穿过基质胶的SK-HEP-1细胞数量降低了27.74%、45.51%、68.77%；48 h内穿过基质胶的SKHEP-1细胞数量降低了47.03%、72.20%、84.07%。以上结果提示{BiW8O30}可显著抑制SK-HEP-1细胞的迁移和侵袭能力。

图2 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1细胞的体外集落形成能力

图3 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1细胞的体外迁移能力

图4 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1细胞的体外侵袭能力

2.4 {BiW8O30}诱导人肝癌SK-HEP-1细胞凋亡

DAPI染色结果(图5A)显示，与对照组相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}处理24 h后，SKHEP-1细胞的数量减少、体积减小，细胞核浓缩、破裂增多。DAPI/Annexin V-Alexa Fluor488/PI三重荧光染色实验结果(图5B)显示，对照组中蓝色荧光信号较强可见，几乎未检测到绿色和红色荧光信号，即活细胞较多，而凋亡细胞很少；50、100、200μmol/L的{BiW8O30}处理SK-HEP-1细胞24 h后，检测到较强的绿色和红色荧光，即活细胞减少，凋亡细胞增多。以上结果表明{BiW8O30}诱导肝癌SK-HEP-1细胞凋亡。

图5 {BiW8O30}诱导SK-HEP-1细胞的凋亡

3 讨论

肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一[15]，由于具有发病隐匿、早期无典型临床症状的特点，肝癌患者往往被确诊时即为肝癌晚期。作为肝癌患者的主要治疗手段，常见的化疗药物如索拉菲尼、阿霉素、顺铂等，能够在一定程度上改善患者的生活质量[16]。然而，长期使用化疗药物可对人体的器官造成严重毒副作用，同时也可引发肿瘤产生耐药性，严重影响疗效[1]。因此，迫切需要开发具有药物疗效和安全性的新药物以改善肝癌的治疗。本课题组前期研究表明，新型多金属氧酸盐药物{BiW8O30}在肉瘤治疗中具有显著抗肿瘤作用[15]。为探究该药物是否适用于其他肿瘤，本研究首次将多金属氧酸盐药{BiW8O30}应用于肝癌细胞。结果显示{BiW8O30}可通过抑制肝癌细胞的增殖、集落形成、迁移、侵袭和诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。

本研究采用CCK-8法细胞增殖实验，检测{BiW8O30}对肝癌细胞增殖能力的影响。结果显示，随着药物浓度的增加，细胞增殖能力被显著抑制，且呈剂量依赖性降低。IC50为药物抑制细胞生长50%所需浓度。已有研究发现，临床常规化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)作用肝癌SK-HEP-1细胞24 h的IC50为115μmol/L[17]，而本研究中{BiW8O30}作用肝癌SK-HEP-1细胞24 h的IC50为(102.07±1.38)μmol/L。这一结果表明{BiW8O30}在肝癌治疗中具有较大潜力。在前期研究中，{BiW8O30}作用肉瘤细胞MG-63的IC50为127.3μmol/L[15]，这提示{BiW8O30}对肝癌细胞具有更强的细胞毒作用，也表明{BiW8O30}可能具有治疗多种肿瘤的潜力。细胞集落形成实验结果显示，{BiW8O30}显著抑制了肝癌细胞干细胞特性和增殖能力。已有的关于多金属氧酸盐药物抗肝癌作用的研究，主要采用低转移潜能的HEP-G2肝癌细胞株。而本研究对象SK-HEP-1具有较高的侵袭与转移潜能，恶性程度较高，利于研究药物对肝癌转移的影响。结果显示，随着{BiW8O30}作用浓度和作用时间的增加，肝癌SK-HEP-1细胞的迁移和侵袭能力被显著抑制，提示{BiW8O30}可能抑制肝癌细胞的转移。

形态学观察显示，{BiW8O30}给药后，肝癌细胞发生了细胞皱缩、体积减小、细胞核固缩碎裂以及形成凋亡小体等改变，提示{BiW8O30}可诱发肝癌细胞凋亡。而课题组前期研究发现{BiW8O30}抗肉瘤作用的方式之一是诱导肉瘤焦亡。同一种药物诱导出两种不同的死亡方式，引起了我们极大的兴趣。近年来，随着对细胞死亡方式的深入研究[18]，研究者发现不同类型的程序性死亡可以归纳为一个单一的、协调的细胞死亡系统。在这个系统中，细胞内各信号通路高度相互关联，相互补偿。2019年Malireddi等[19]发现了一条新型细胞死亡途径，称为PANopossis，此通路由PANoptosome复合体调控，焦亡、凋亡和程序性坏死同时参与。

凋亡、焦亡、程序性坏死是细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)中的3个关键途径。其中，凋亡由半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的激活、调亡小体的形成介导，焦亡由炎性小体的调节、Gasdermin家族成员的激活介导，程序性坏死由RIPK1、RIPK3和MLKL的激活，胞质坏死小体的形成介导[20]。3条途径既能独立激活，又能相互关联[21]。如凋亡和焦亡通路的介导均依赖Caspase家族成员的激活，焦亡和程序性坏死的发生均有炎性因子的释放，凋亡、焦亡、程序性坏死均有脂质过氧化的参与等。以往的大部分研究都集中在个别的细胞死亡方式上，而不同的PCD途径是否是独立发生的尚不清楚，仍有待进一步研究。结合本课题组前期研究和上述结果，{BiW8O30}是否通过诱导肿瘤细胞多种死亡方式，从而起到抗肿瘤作用，其机制又是否与PANoptosis新型死亡途径相关，有待我们进一步探究。

综上所述，本研究首次发现新型多金属氧酸盐药物{BiW8O30}对肝癌SK-HEP-1细胞的体外抗肿瘤作用。{BiW8O30}可显著抑制肝癌细胞SK-HEP-1的增殖、迁移和侵袭能力，并可诱导细胞凋亡。本研究为今后该药物在肝癌治疗中的临床应用提供了实验依据，具有重要现实意义和临床价值。