丹参酮ⅡA磺酸钠对环境细颗粒物诱导的大鼠肺部损伤的保护作用

陈东亚，陆罗定，陈 耿，张 颖，俞 萍，吕中明，卞 倩*

(江苏省疾病预防控制中心毒理与风险评估研究所，江苏 南京 210009)

目前的流行病学研究表明长期暴露于环境细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)中，可能引发哮喘、肺功能下降、心血管疾病、神经毒性等[1-4]。PM2.5主要成分为矿物粉尘、多环芳烃、硫酸盐和铵等[5]，因为其能沉积在呼吸道及肺泡中，且难以清除，其所致损伤主要表现为肺部炎性病变，炎性细胞浸润和炎性因子如白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-6(interleukin-6，IL-6)等的增加[6-8]。

丹参酮ⅡA磺酸钠(sulfotanshinone sodium，STS)是从中草药丹参中提取并磺化的物质，具有改善血液循环、促进血管内皮细胞修复、抗血栓等作用，目前临床已被广泛用于治疗心血管疾病，其更多药理作用还在被继续探索。Xu等[9]报道，STS可通过抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)通路介导的细胞凋亡和炎症反应来减轻脂多糖引起的小鼠急性肺损伤。高辉等[10]报道，STS联合布地奈德和异丙托溴铵雾化吸入可显著改善慢性阻塞性肺病急性加重期患者的肺功能和免疫功能。而目前关于STS对PM2.5诱导的肺部炎症的相关研究较少。因此本研究在建立PM2.5气管滴注大鼠肺部炎症模型基础上，探索STS对大鼠肺部炎症反应的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂包括：STS(上海第一生化药业有限公司)；空气细颗粒物标准物质(美国国家标准和技术研究所)；地塞米松片(广东华南药业集团有限公司)；大鼠CD3-4-8检测试剂盒(美国BD公司)；IL-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6 ELISA检测试剂盒(南京翼飞雪生物科技有限公司)；细胞浆和细胞核蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗NF-κB P65多克隆抗体及磷酸化p-P65多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

主要仪器包括：酶标仪(Paradigm型，美国MD公司)；小动物肺功能-全身体积描记检测系统(WBP型，美国BUXCO公司)；低温高速离心机(MIKRO 220R型，德国Hettich公司)；流式细胞仪(C6，美国BD公司)；Mini-PROTEAN型电泳仪和Trans-Blot型转膜仪(美国Bio-Rad公司)；成像仪(C280型，美国Azure Biosystems公司)。

1.2 造模及给药

24只清洁级雄性SD大鼠，初始体质量180~200 g，动物生产许可证号为SXK(苏)2016-0002，由南京医科大学提供，在动物饲养室适应性喂养1周后，随机分为4组，每组6只，分别为对照组、PM2.5染毒组(模型组)、丹参酮ⅡA磺酸钠组(STS组)、地塞米松组(阳性对照)。染毒浓度设定依据参见本课题组前期发表的论文[11]。本研究采用气管滴注PM2.5悬液染毒，除对照组气管滴注生理盐水外，其余3组染毒剂量均为5.4 mg/kg，每3 d滴注1次，共10次，于染毒第1天起STS组和地塞米松组分别以浓度15 mg/kg和0.5 mg/kg腹腔注射，每天1次，持续28 d。末次染毒后2 d，经腹主动脉采血2 mL，处死后灌洗左肺，收集肺泡灌洗液5 mL，右肺上叶置于液氮冻存。

1.3 大鼠呼吸功能测定

末次染毒后24 h，采用整体体积描记法(whole body plethysmography，WBP)，将大鼠置于测量腔内，在安静且温度和湿度适宜环境中，适应10 min，待呼吸波形平稳后，测定各组大鼠的呼吸频率(respiratory frequency，f)和被迫呼吸间隙(enhanced pause，Penh)。

1.4 血液淋巴细胞亚群分析和肺泡灌洗液炎症因子检测

分离各组大鼠血液淋巴细胞，将浓度调整为1×106个/mL，取100μL淋巴细胞悬液分别与CD3和CD4、CD3和CD8的抗体组合孵育。样品在室温下黑暗处孵育20 min，PBS洗涤两次后，使用流式细胞仪测定每个样本1×104个淋巴细胞的荧光强度，分析CD3+、CD4+和CD8+比例。

肺泡灌洗液炎症因子的检测，按照IL-1β、TNFα和IL-6 ELISA试剂盒含量检测说明书操作。

1.5 Western blot检测NF-κB蛋白表达

按照说明书分别提取肺组织细胞核、细胞浆蛋白。BCA法测定蛋白含量，煮沸变性后，取40μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，将膜室温封闭1 h，一抗NF-κB P65、磷酸化p-P65、GAPDH和Lamin B1均为1∶1 000稀释，4℃过夜，二抗(1∶5 000稀释)孵育1 h，洗涤后ECL化学发光显影，Azure成像系统检测条带，利用Image J1.52V软件对条带灰度值进行测定，与对应内参比较后，计算相对值。

1.6 统计学检测

使用SPSS 20.0统计软件分析，各组数据用±s表示，当多组间方差齐时，使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；方差不齐时，采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STS对染毒后大鼠肺功能的影响

如表1所示，与对照组相比，模型组呼吸f值和Penh值均明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，丹参酮ⅡA磺酸钠组和地塞米松组呼吸f值的差异均无统计学意义(P＞0.05)，而被迫呼吸间隙Penh值均降低(P＜0.05或P＜0.01)；另外，丹参酮ⅡA磺酸钠组和地塞米松组间f值和Penh的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠肺功能变化(n=6，±s)

表1 各组大鼠肺功能变化(n=6，±s)

与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别对照组模型组丹参酮ⅡA磺酸钠组地塞米松组呼吸频率/(次/min)251.31±22.91 286.29±14.23**269.80±19.19 266.53±13.91被迫呼吸间隙0.43±0.08 0.62±0.13**0.46±0.04##0.50±0.09#

2.2 STS对染毒后大鼠外周血淋巴细胞的影响

如表2所示，各组大鼠外周血淋巴细胞CD3+、CD8+细胞百分率差异无统计学意义，与对照组比较，模型组CD4+细胞百分率降低(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值降低(P＜0.05)；相较于模型组，丹参酮ⅡA磺酸钠组和地塞米松组CD4+细胞百分率均升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值亦升高(P＜0.01或P＜0.05)，但丹参酮ⅡA磺酸钠组和地塞米松组间CD4+细胞百分率和CD4+/CD8+比值的差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠外周血中T淋巴细胞亚群比较(n=6，±s)

表2 各组大鼠外周血中T淋巴细胞亚群比较(n=6，±s)

与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01.表格中CD4+数据方差不齐，采用非参数检验，其他数据统计采用单因素方差分析.

组别对照组模型组丹参酮ⅡA磺酸钠组地塞米松组CD3+/%64.71±3.92 61.81±3.49 65.95±4.02 62.25±1.85 CD4+/%31.05±2.65 23.20±1.63**33.40±3.98##27.82±2.38##CD8+/%25.25±3.44 23.02±2.62 24.02±2.84 23.82±1.90 CD4+/CD8+1.25±0.18 1.02±0.14*1.36±0.26##1.17±0.09#

2.3 STS对大鼠肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β、TNF-α及IL-6的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α和IL-6浓度升高(P＜0.01)；与模型组相比，丹参酮ⅡA磺酸钠组和地塞米松组IL-1β、TNF-α和IL-6浓度均降低(P＜0.01或P＜0.05)，但丹参酮ⅡA磺酸钠组和地塞米松组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

表3 各组大鼠炎症因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表达(n=6，±s)

表3 各组大鼠炎症因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表达(n=6，±s)

与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别对照组模型组丹参酮ⅡA磺酸钠组地塞米松组IL-1β/(ng/L)33.79±4.99 41.72±3.04**35.83±2.77#34.37±3.77##TNF-α/(ng/L)278.64±34.25 359.43±36.22**310.95±30.64#305.82±30.35#IL-6/(ng/L)146.39±18.24 182.21±15.64**156.86±16.05#153.44±17.23#

2.4 STS对NF-κB P65和p-P65蛋白表达的影响

如图1所示，与对照组相比，模型组肺细胞浆中P65含量降低(P＜0.01)，细胞核中p-P65含量升高(P＜0.01)；与模型组相比，丹参酮ⅡA磺酸钠组和地塞米松组细胞浆中P65含量升高(P＜0.05)，细胞核中p-P65含量降低(P＜0.01)；另外，丹参ⅡA磺酸钠组和地塞米松组间的差异无统计学差异(P＞0.05)。

图1 各组大鼠肺细胞浆和细胞核中NF-κB P65和p-P65蛋白表达(n=3)

3 讨论

大气PM2.5引起的非传染性疾病已成为严重的公共卫生问题[12-13]，因此PM2.5对机体的损伤机制和干预方法的探索成为当前的研究热点。本研究采取大鼠气管滴注染毒法造模，并对STS的干预作用进行评价。

在研究PM2.5对肺部影响时，肺功能指标是一项直观的数据，有报道表明人类长期吸入细颗粒物会引起呼吸功能下降，造成肺部损伤[14-15]。本研究采用无创WBP法对大鼠肺功能进行检测，相比于有创检测法，该方法操作较简便，动物始终保持清醒状态，减少了手术和麻醉对指标的影响，且不影响后续其他指标的检测。当大鼠出现肺泡壁增厚、肺泡腔减小、肺间质炎性细胞浸润、肺间质纤维化等病理改变时，f和Penh数值增加，提示肺部通气不足，气道阻力增加，且与炎症程度相关[16-17]。本课题组前期结果表明STS能改善PM2.5染毒后大鼠肺组织炎性病理改变[11]，本研究结果显示模型组大鼠f和Penh增加，而STS组和地塞米松组能改善PM2.5引起的肺功能下降，降低f和Penh，与前期病理研究改变结果一致。

血液T淋巴细胞亚群在正常机体中呈现相互作用，相互平衡，维持机体正常细胞免疫功能。研究[18]报道，吸入PM2.5导致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)小鼠T淋巴细胞失衡，并使COPD加重。朱敏立等[19]发现空气污染导致大鼠T淋巴细胞构成异常。本研究中，与对照组相比，模型组大鼠染毒后CD4+细胞百分率降低，CD4+/CD8+比值降低；而与模型组相比，STS组通过升高CD4+细胞数，提高CD4+/CD8+比值改善PM2.5导致的T淋巴细胞亚群比例失衡，达到免疫平衡状态，这与之前报道的STS具有免疫调节作用相一致[20-21]。而地塞米松组CD4+/CD8+比值与模型组相比差异无统计学意义，调节T淋巴细胞亚群比例的作用不如STS，可能与地塞米松诱导免疫抑制有关。

由肺泡巨噬细胞释放的IL-1β是PM2.5暴露后释放的急性反应细胞因子，与细胞表面受体结合后，激活JNK或p38通路，促进TNF-α等细胞因子分泌[22]。TNF-α也是肺部炎症的早期细胞因子之一，由肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞释放，促进循环中炎症细胞与内皮细胞的黏附[23]。IL-6主要来源于单核-巨噬细胞系统，具有促进细胞增殖分化、调节免疫应答等功能，通过自分泌或旁分泌的形式参与气道和肺部炎症的发生发展[24-25]。有研究[26]表明，PM2.5通过激活IKK/NF-κB信号途径激活NF-κB P65，使其磷酸化为p-P65并进入细胞核提高炎症因子水平。PM2.5通过诱导自噬，增加P65磷酸化促进炎症因子表达[27]。此外，IL-1β和TNF-α能诱导抑制蛋白IκB的快速磷酸化和降解来诱导NF-κB快速核移位，通过反向调节进一步从转录水平调节炎症因子的表达，加重肺部炎症[28-29]。本实验模型组大鼠经PM2.5染毒后，肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6浓度与对照组相比明显升高，细胞核内p-P65蛋白含量增加，这与之前研究报道一致，而STS组和地塞米松组大鼠炎症因子水平和核内p-P65蛋白含量降低，说明两者能通过降低炎症因子表达，抑制NF-κB P65激活，减轻肺部炎症。

STS是从丹参根部提取的主要成分，具有丹参大部分药效特性，且副作用小[30]。研究[31]表明STS可以减少脑动脉闭塞大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，通过减少NF-κB P65磷酸化降低神经炎症。李春陵等[32]研究发现，大鼠腹腔注射32 mg/(kg·d)STS，14 d后通过上调PPARγ蛋白表达，下调NF-κB蛋白表达，抑制气道重塑因子TNF-α、IL-6水平，从而防止COPD大鼠气道重塑。在课题组前期研究基础上，本研究通过肺功能、免疫功能和炎症因子检测，进一步表明STS可能通过抑制NF-κB激活、降低炎症因子表达、提高机体细胞免疫能力、减轻肺部炎症从而改善肺功能。地塞米松作为常用的肾上腺皮质激素，具有较好的抗炎效果，但是长期使用对免疫系统的抑制不容忽视。而多个临床报告[33-34]表明，STS连续静脉滴注4周用于治疗冠心病等疾病时，未见严重药物不良反应或并发症。因此STS在PM2.5所致肺部炎症多次给药治疗中具有一定的应用前景。

综上所述，STS可能通过抑制NF-κB激活，降低炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6表达，减轻PM2.5导致的大鼠肺部炎症损伤，改善肺功能和免疫功能。本研究为明确STS对PM2.5致肺部炎症损伤的干预作用提供了参考依据，但STS具体作用靶点，如何抑制NF-κB激活的上游因子，以及是否通过其他途径调节机体损伤均有待进一步研究。另外，可尝试改变染毒方式为全身暴露染毒等作更深入探讨。