甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE细胞恶性转化过程中LncRNA表达特征分析及ceRNA调控网络预测

李昕苇，王全凯，马顺鹏，王 苗，乌瀚宝栎尔，顾轶婷，康同影，许建宁，*

（1．中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050；2．中国疾病预防控制中心化学污染与健康安全重点实验室，北京 100050）

甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又称甲基丙烯酸缩水甘油酯，主要在丙烯酸粉末涂料、乳胶涂料、胶粘剂的合成和加工中被广泛使用。目前国际癌症组织(International Agency for Research on Cancer，IARC)已完成对GMA的致癌性评估，根据“强有力”的致癌机制证据及“充分”的实验证据，将GMA归类为“对人类很可能致癌”(Group 2A)[1]。本课题组既往研究发现，在GMA诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中，细胞基因组和表观遗传学发生异常改变，过程中涉及众多细胞信号转导通路，并可能导致下游分子蛋白的一系列改变[2-4]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一种具有200多个核苷酸、未翻译成蛋白质的转录本，通常认为它是基因转录和染色质结构的限制调节因子，然而，随着研究的深入，LncRNA逐渐受到覆舟关注，亦发现它们具有翻译调节、信号转导等多种功能[5]。竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)是LncRNA通过结合微小RNA(microRNA，miRNA)应答元件竞争性吸附miRNA，抑制miRNA与信使RNA(message RNA，mRNA)结合，从而导致靶基因沉默[6]，其中，LncRNA与mRNA之间存在正调控关系，与miRNA存在负调控关系[7]。因此本次试验对GMA诱导细胞恶性转化不同时期差异表达的LncRNA进行检测分析，并以此为依据构建ceRNA调控网络，对差异表达的LncRNA功能进行预测和分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

GMA(纯度≥98.5%)和二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司(美国)；胰蛋白酶、EDTA-Na2购于Amresco公司(美国)；MEM培养基粉购于Hyclone公司(美国)；标准胎牛血清购于Gibco公司(美国)；100×的青、链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司；TRIzol试剂购于上海碧云天生物技术有限公司，2×PCR master mix购于Arraystar公司(美国)。

本研究使用的主要仪器有：CO2培养箱(Thermo公司，美国)；台式高速低温离心机(BECKMAN公司，美国)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；紫外可见分光光度计(UNICO公司，美国)；7900HT Fast Real-Time PCR仪(Biosystems公司，美国)；ND-1000分光光度计(NanoDrop公司，美国)；ViiA 7实时定量PCR反应体系(Applied Biosystems公司，美国)。Arraystar Human LncRNA Microarray V4.0芯片技术服务和引物设计及ceRNA调控网络构建的技术支持由上海康成生物公司提供。

1.2 细胞培养

人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells，16HBE)来自美国加利福尼亚大学，将冻存于液氮中的细胞复苏后，用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化后，用10%标准胎牛血清(FBS)的MEM培养液，于37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养过夜。基于课题组既往关于GMA的细胞毒性和克隆形成率的研究结论，选择浓度为8μg/mL的GMA重复染毒诱导16HBE细胞发生恶性转化[8]。取对数生长期的细胞进行接种，24 h后向培养液中加入浓度为8μg/mL的GMA进行染毒(DMSO作为对照)。每次染毒时间72 h，间隔24 h后进行2次染毒，重复染毒3次后结束染毒，记为第1代；MEM培养液调整为5%FBS继续培养，每隔5 d传代1次。课题组既往研究[9]表明，传代培养至第30代，GMA染毒组的16HBE细胞具备恶性转化细胞的生物学特性。根据课题组既往ConA凝集试验及锚着非依赖性试验的研究结果，选择收取第10、20和30代的GMA染毒组细胞和DMSO对照组细胞，记为转化前(P10)、中(P20)和后期(P30)。

1.3 LncRNA芯片分析

收集GMA处理组和DMSO对照组的P10、P20和P30细胞，TRIzol提取总RNA，使用NanoDrop-1000分光光度计检测RNA浓度和纯度，于-80℃冰箱中保存备用。使用Arraystar RNA Flash标记试剂盒标记总RNA样品，再使用Agilent SureHyb进行杂交实验，完成杂交后洗涤芯片，采用Agilent DNA Microarray Scanner扫描芯片的信号值，标准化处理后得到不同时期细胞LncRNA表达谱。

最后，通过人工检索GMA重复染毒诱导16HBE细胞恶性转化过程中P10、P20和P30代细胞LncRNA表达谱的差异性表达结果，以3个时期差异倍数的对数绝对值|log2FC|≥2.0且P＜0.05为标准筛选得到在不同时期表达水平均上调的LncRNA，确定GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程及其不同时期涉及的相关LncRNA。

1.4 ceRNA调控网络构建

ceRNA调控网络根据miRNA建立调控关系，因此以表达水平具有上调趋势的LncRNA为中心，通过TargetScan和miRanda数据库进行差异性表达LncRNA靶基因的预测[10-11]，根据超几何检验来验证LncRNA与mRNA之间是否存在ceRNA关系及其显著性差异，公式如下：

经过筛选后得到P＜0.05的ceRNA对用于构建ceRNA调控网络。在此基础上，利用网络工具Cytoscape构建GMA诱导16HBE细胞恶性转化的ceRNA调控网络。

1.5 实时荧光定量PCR验证LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116的表达水平

使用逆转录试剂盒(Invitrogen)将已提取的P10、P20和P30代细胞的总RNA样品反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)反应，引物序列见表1。qPCR体系(10μL)：2×Master Mix 5μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板2μL及无核酸酶水2μL；扩增条件为：95℃，预变性10 min；95℃，变性10 s；60℃，退火60 s，40个PCR循环。以管家基因βactin为内参，同期DMSO对照组基因的平均值为基准，以GMA组基因表达量除以样品内参基因表达量，得到的比值即所验证的LncRNA的相对表达量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计分析，LncRNA相对表达量的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中LncRNA芯片的筛选结果

对GMA重复染毒诱导16HBE细胞恶性转化过程中P10、P20和P30代细胞LncRNA芯片结果进行分析，筛选得到在不同时期表达水平均上调的LncRNA共16个，见图1，差异性表达LncRNA变化情况如表2所示。其中恶性转化的P20细胞中AP000619.5、CTA-384D8.35及G071314表现尤为明显，与同代龄DMSO溶剂对照组相比上调超过10倍。

图1 GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中表达水平一致性上调的LncRNA

表1 qPCR测定的引物序列

表2 第10、20、30代染毒组细胞中表达一致性上调的LncRNA

2.2 ceRNA调控网络的构建和功能富集分析

通过TargetScan和miRanda数据库预测GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中差异表达的16个LncRNA的目标靶向mRNA和miRNA，二者结果取交集后，进行超几何分析并计算ceRNA对之间表达量的Pearson相关系数＞0.9，最终筛选出3个关键的差异表达LncRNA，32个mRNA和204个miRNA，并以此为基础构建GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程相关的ceRNA调控网络，见图2。构建的ceRNA调控网络结合hub基因评分，发现LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116可能通过LncRNA G013234-hsamiR-378b-TMEM129、LncRNA CTA-384D8.35-hsamiR-486-3p-LYPD、LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1调控轴在GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中发挥作用。

2.3 LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116相对表达量的检测结果

绿色圆形：LncRNA；蓝色圆形：mRNA；红色圆形：miRNA.

表3 qPCR检测不同时期16HBE细胞LncRNA相对表达水平

对构建ceRNA调控网络的关键差异表达LncRNA进行qPCR检测，结果见表3。与同代龄DMSO对照组相比，GMA组细胞LncRNA G013234、CTA-384D8.35和G087116相对表达量在P10、P20和P30代细胞中均上调。除G087116在P10代细胞中表达量差异无统计学意义(P＞0.05)外，其余LncRNA的相对表达量在两组间差异均具有统计学意义(P＜0.05)。qPCR检测结果显示细胞不同时期LncRNA相对表达水平的变化趋势与芯片检测结果一致。

3 讨论

LncRNA是一类进化保守的非编码RNA，参与细胞表观遗传调控、周期调控、分化调控等过程，同时LncRNA可能包含未被发现的细胞恶性转化驱动因子。LncRNA可以通过RNA-蛋白质，RNA-RNA和RNA-脂质相互作用，在细胞恶性转化过程中发挥关键的信号转导介质作用[12]。本研究主要研究在GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化过程中相关差异表达LncRNA的筛选及表达改变，并以此为基础构建ceRNA调控网络，探讨LncRNA在16HBE细胞恶性转化过程中可能存在的生物学作用。

本研究采用GMA重复染毒诱导16HBE细胞恶性转化，根据P10、P20和P30代细胞的芯片检测结果，筛选在细胞恶性转化不同时期差异表达的LncRNA，共发现16个LncRNA在不同时期表达均发生上调，以差异性表达上调的LncRNA为基础构建ceRNA调控网络，构建的ceRNA调控网络包含3个关键的差异表达LncRNA即G013234、CTA-384D8.35及G087116，32个mRNA和204个miRNA。在PubMed、万方、中国知网等文献数据库中检索上述关键差异表达LncRNA的相关文献，并在NCBI、Ensemble等数据库中查询这些LncRNA相关注释信息，发现LncRNA G013234、CTA-384D8.35及G087116可以检索到参与肿瘤发生发展的研究及相关文献。后经qPCR检测ceRNA调控网络中LncRNA在细胞恶性转化不同时期的相对表达量，检测结果与芯片结果一致，进一步说明上述LncRNA可能在GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中发挥重要作用。

CeRNA调控网络的构建为LncRNA和mRNA之间更复杂精细的调控提供了假说，也为研究LncRNA在细胞内的功能及与其他编码、非编码RNA的相互作用提供了新的思路[13]。在本研究构建的ceRNA调控网络中，LncRNA G013234-hsa-miR-378b-TMEM129，LncRNA CTA-384D8.35-hsa-miR-486-3p-LYPD，LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1这3个调控轴是与GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程关联较为密切的ceRNA三元组(P＜0.05)。Li等[14]发现，胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)组织中CTA-384D8.35表达与IL-6呈正相关，同时CTA-384D8.35直接结合IL-6启动子，激活IL-6转录，并上调IL-6表达和分泌以激活PDAC细胞中STAT3信号通路；且胰腺导管腺癌中PanIN-3病变部位miRNA hsa-miR-486-3p发生异常过表达[15]。目前有研究表明，hsa-miR-486-3p在类风湿性关节炎患者的血液中异常表达且富集到靶基因产物STAT3[16]。而Xu等[17]发现LYPD可通过抑制IL-6和TNF-α的分泌来调控结直肠癌细胞的增殖和迁移，并且TNF-α和IL-6的分泌与STAT3和P65的磷酸化呈正相关。因此，LncRNA CTA-384D8.35可能通过与hsa-miR-486-3p的相互作用调节细胞因子IL-6的表达，进而影响STAT3信号通路的传导，导致LYPD在GMA诱导16HBE恶性转化细胞中的分泌改变，从而影响细胞的增殖和迁移等活动。

有研究表明has-miR-378在胆管癌中可作为癌基因发挥作用，促进胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭[18]，且has-miR-378参与骨肉瘤的发生及其肺转移的生物学过程[19]。TMEM129是非糖基化蛋白，包含一个非剪切信号锚定序列，可用于催化分泌蛋白细胞质降解所需的泛素化反应[20]；而TMEM129所涉及的DNA甲基化过程也与黄种人和白种人的早期肺腺癌的预后有关[21]。上述研究表明，LncRNA G01323可能调节TMEM129所涉及的DNA甲基化过程，从而激活原癌基因has-miR-378b，在GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化。

Zhang等[22]的研究表明，miR-29b-3p通过下调TRAF3促进MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞的进展。NAV1是一种主要在神经元中发现的蛋白，为电压门控钠离子通道，据报道在微管发育中发挥关键作用[23]。亦有文献报道其在乳腺癌、前列腺癌等肿瘤细胞中出现异常表达，如Luo等[24]研究显示，Nav1以电压门控钠通道的形式在转移性乳腺癌细胞中异常激活和表达，从而增强乳腺癌细胞在体内外的转移和侵袭性。Papadopoulos等[25]的研究表明，在单侧输尿管梗阻的体外试验中，NAV1遵循经典的调控模式，即miR-29b-3p的上调导致靶标NAV1的下调，证实NAV1可能是miR-29b-3p的直接靶点；同时有报道指出，根据时间和条件的改变，miRNA可能与诱导其靶标mRNA的调控方向相同，这亦为miR-29b-3p调控NAV1可能的间接机制提供了解释[26]。因此，LncRNA G087116可能通过调节miR-29b-3p的表达导致NAV1的表达改变，从而参与GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程。

本研究通过LncRNA芯片分析和qPCR验证发现，在GMA诱导16HBE细胞恶性转化不同时期细胞中LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116发生表达上调。以上述差异表达LncRNA为基础构建的ceRNA调控网络及预测得到GMA诱导细胞恶性转化相关的关键mRNA，筛选出LncRNA G013234-hsa-miR-378b-TMEM129、LncRNA CTA-384D8.35-hsa-miR-486-3p-LYPD、LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1调控轴，并且这些调控轴可能在GMA诱导16HBE细胞恶性转化的过程中发挥重要作用。