HPLC同时测定痔清舒洗剂中绿原酸、咖啡酸和盐酸小檗碱的含量

谭本仁，郑锦坤，黄义纯，徐晓梅，刘宴林

（1.汕头大学医学院附属粤北人民医院，广东 韶关 512026；2.韶关市食品药品检验所，广东 韶关 512028）

痔清舒洗剂是汕头大学医学院附属粤北人民医院基于传统中医理论和临床实效研制的中药复方外用洗剂，已应用于临床多年，效果明显，疗效确切，受到患者的一致好评，该制剂具有清热解毒、燥湿止痒、行气活血、消肿止痛等功效，主要由大黄、蒲公英、黄柏、没药等多味中草药提炼而成。现行质量标准为广东省药品监督管理局医疗机构制剂注册标准（粤ZB20111771），标准仅规定了颜色、气味等性状、个别药材鉴别、相对密度和PH值等，对主要成分未有定量分析标准。前期本人仅对痔清舒洗剂中大黄素和大黄酚进行了HPLC含量检测[1]，本实验拟采用HPLC法同时测定痔清舒洗剂中的绿原酸、咖啡酸和盐酸小檗碱三种主要水溶性成分。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（安捷伦公司Aglient 1260），岛津SHIMADZU（LC-30AD）；色谱柱：伊力特Hypersil ODS2（5 µm，250 mm×4.6 mm），Kromasil 100-5-C18（5 µm，250 mm×4.6 mm），Agilent ZORBAX RX-C18（5 µm，250 mm×4.6 mm）。METTLE TOLEDO AG135电子天平（精密0.000 01g）；HT-300BQ超声波清洗仪（济宁恒通）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号：110753-201817，纯度：96.8%）、咖啡酸对照品（批号：110885-200102，纯度：100%）盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201814，纯度：86.7%）（中国食品药品检定研究院）；痔清舒洗剂（粤北人民医院制剂，批号分别为：20200212，20200227，20200617）；乙腈、甲醇为色谱纯，TEDIA公司，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

用十八基硅烷键合硅胶为填充剂，经反复多次预试验确定采用梯度洗脱，乙腈为流动相A，1%磷酸为流动相B，洗脱梯度见表1。

表1 流动相洗脱梯度

柱温：30℃；流速：1 mL·min-1；检测波长为324 nm，进样量10 μL。理论板数按绿原酸计算应不低于3 000。

2.2 溶液的制备

精密称取绿原酸对照品、咖啡酸对照品和盐酸小檗碱对照品适量，加50%甲醇分别制成浓度为0.710 5 mg·mL-1、0.203 2 mg·mL-1和 0.185 2 mg·mL-1的对照品溶液。精密量取痔清舒洗剂约20 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液。根据痔清舒洗剂说明书中4味药的比例配制成缺主药的阴性药品作为研究对象，按照所提供4种药物试品溶液的制备方法，制备成实验所需的阴性对照溶液。

2.3 线性范围考察

分别吸取“2.2”项下3种对照品溶液各0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL置5个10 mL量瓶中，将医用甲醇溶解并稀释至所标注的刻度，轻轻摇匀，即得所需的稀释后的甲醇溶液。精密吸取各10 µL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以对照品的含量为横坐，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得出绿原酸、咖啡酸和盐酸小檗碱的回归方程及相关系数分别为：y绿原酸=1.236 9×104x＋6.225 3×104（r= 0.998 3），y咖啡酸= 2.862 8×104x＋5.606 2×103（r= 1.000），y盐酸小檗碱 =1.815 3×104x＋4.463 9×103（r= 1.000）。结果表明：绿原酸在 7.105 µg·mL-1～ 142.1 µg·mL-1、咖啡酸在 4.064 µg·mL-1～ 81.28 µg·mL-1和盐酸小檗碱在5.556 µg·mL-1～ 111.16 µg·mL-1呈良好的线性关系。

2.4 专属性实验

精密吸取阴性对照溶液适量，按“2.2”项下色谱条件下进行样测定，结果在与对照品溶液绿原酸、咖啡酸及盐酸小檗碱出峰位置上无相应色谱峰，表明阴性对照无干扰。见图1、图2、图3。

图1 对照品图谱

图2 供试品图谱

图3 阴性对照品图谱

2.5 加样回收率试验

取已知含量的供试品溶液共18份，分别置10 mL量瓶中，并精密加入适量的3种对照品溶液，加70%甲醇定容至刻度，按“2.2”项下色谱条件分别进样10 μL，测定，计算回收率及RSD，结果见表2。

表2 加样回收率实验结果

3 讨论

痔清舒洗剂是由大黄、蒲公英、黄柏、没药等多味中草药组成，大黄性味苦寒，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效[2]。大黄具有广泛的药理活性，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化应激、抗肿瘤、抗纤维化、止血、调脂、降糖、调节免疫力等药理作用[3-4]，临床用于治疗实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、牙龈肿痛、臃肿疔疮、肠痈腹痛、烧烫伤等[2]。蒲公英具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋的功效[2]，针对蒲公英提取物和单体活性成分的研究，其药理上具有抑菌和抗病毒的作用，具有广谱抑菌作用，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和病毒均有不同程度的抑制作用，蒲公英具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、免疫抑制、抗突变、胃肠黏膜保护、保护心肌细胞、降血糖、利尿等作用[5-6]。黄柏性苦味寒，具有清热燥湿、泻火解毒、除蒸疗疮的功效[2]，临床广泛用于治疗湿热痢疾、泄泻、黄疸、骨蒸劳热、湿疹湿疮、疮疡肿毒等病症[7]。抗菌、抗炎、解热、抗癌、抗细胞凋亡、抗氧化、抗病毒、抗感染、滋阴、降血糖等作用，对免疫系统、心血管系统、消化系统均有一定的影响[8-9]。没药性味辛苦平，具有散瘀定痛、消肿生肌的功效[2]。该药具有抗炎、镇痛和抗血脂的作用，临床用于治疗折伤马坠，跌打损伤，骨节疼痛，金疮杖疮，恶疮痔漏，平产后血刺，痈疽肿痛、疮疡溃后久不收口及多种瘀滞痛症，兼坠胎孕，除目中障翳，心虚胆怯，肝血不足等症[10-11]。该方中诸药配伍合理，具有清热解毒、燥湿止痒、行气活血、消肿止痛的功效,主治炎性外痔、痔嵌顿，术后肛缘水肿等症。所测定的3种有效成分具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖和免疫调节等多方面的药理作用[12-14]，与痔清舒洗剂所含的有效成分的药理作用相似。

中药复方制剂为多体系组分复杂，常具有水溶性及脂溶性主要成分，在痔清舒洗剂水溶性主要成分的质量控制中，参考了2015年版《中国药典》和相关文献[15-19]，经过反复的试验，采用以甲醇、乙腈和1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，绿原酸、咖啡酸及盐酸小檗碱三种成分的色谱峰峰形对称，得到的分离效果最佳，阴性溶液对照无干扰，参照的系统适应性较佳，所采用的HPLC含量测定方法能较好地测定绿原酸、咖啡酸及盐酸小檗碱3种成分的含量，试验结果提示该测定方法可行性强，重复性好，基于前期对痔清舒洗剂中大黄素和大黄酚含量测定的试验基础，该测定方法和测定目标的选定用于痔清舒洗剂的质量控制及质量标准完善具有积极的意义。

综上所述，所建立的痔清舒洗剂含有多种药理活性，具有抗菌、抗炎、抗病毒、免疫抑制、抗溃疡等作用，既为合理用药提供依据，又是临床用药安全提供保证[20]。所含有的绿原酸、咖啡酸及盐酸小檗碱从色谱条件与系统适用性试验、溶液的制备、线性范围考察、加样回收率试验等方面所测定的质量标准，解决了其质量控制的难点，客观地评价了痔清舒洗剂质量的稳定性、有效性，能够为其质量控制提供参考依据。