中医药治疗实验性自身免疫性重症肌无力作用机制研究进展

张艺缤，王百通，吕志国，张冬梅，徐 鹏，吴 桐，刘 淼，吴 雷，陈助明，王 健*

（1.长春中医药大学中医学院，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种典型的由自身抗体介导引起的发生在神经肌肉接头处（neuromuscular junction，NMJ）的自身免疫性疾病，临床表现为骨骼肌肌肉无力和易疲劳，其特点是晨轻暮重，活动后加重、休息后可减轻[1]。一项大型研究报告指出发病率1.55/10万，流行率3.66/10万[2]，发病高峰出现在年轻的成年女性和老年男性[3]。

在发病机制上，乙酰胆碱受体（AChR）抗体阳性占据大多数，大约80%的MG患者中发现AChR抗体呈阳性。且在这类患者中AChR-α亚基阳性＞50%[4]。大约7%～10%的MG患者和高达40%的AChR抗体阴性的全身性MG患者中发现了肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK）抗体[5]。2%～50%的双血清阴性MG患者中低密度脂蛋白受体相关蛋白（Lrp4）抗体呈阳性[6]。

目前，MG的治疗仍以胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂为主，近年来靶向生物制剂逐渐兴起，被行业内所认可，静脉注射免疫球蛋白、血浆置换以及胸腺切除以其治疗成本高及创伤大等原因很少被广泛应用于临床[7]。然西医的治疗多是对症治疗，治标而不治本，且多有毒副作用，治疗后患者多反复，研究表明，中医药不仅对本病有较好的疗效,而且已形成自己的鲜明特色，并能较好地在实践中应用[8]。近年来，中医药治疗MG作用机制的研究成为热点，回顾总结中医药对实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）作用机制的研究进展，为治疗MG中药新药的开发及实验设计提供思路，为中医药治疗MG临床应用提供更可靠的理论依据。

1 实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）动物模型制备方法

回顾总结近10年中英文文献，在造模动物种属选择上都选的是大鼠或小鼠，品系C57BL/6小鼠和Lewis大鼠，性别都是选用雌性。在纳入的研究中造模制备方法共有四种：1）采用人工合成鼠源性AchR-α亚基97-116肽段通过构建EAMG模型应用最多。每200 μL含AchR-α亚基97-116肽段50 μg、结核分枝杆菌H37Ra干粉1 mg，多点皮下注射于造模鼠的肩背部、尾基部、足垫部，第2、3次加强免疫将与不完全弗氏佐剂（IFA）充分混匀含AchR-α亚基 97-116肽段 50 μg、结核分枝杆菌H37Ra干粉1 mg，在相同部位注射强化免疫。2）采用将人工合成AchRα1（129-145）多肽片段按照1/2的比例与CFA完全乳化，配比按照200 μL溶液内含有50 μg多肽片段，皮下注射。3）利用免疫亲和层析技术从美国加州电鳐（torpedo of Californica）的电器官中提取、纯化乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AchR），并将纯化的AchR与完全福氏佐剂（CFA）以50 μg:200 μL的比例混合，制备成免疫原，在动物的背部、后足趾、尾根部选择多个注射点分2～3次免疫小鼠。4）收集初诊或近一个月内未服用过激素类药物的MG患者血液，将分离出的血清每次0.8 mL注入免疫小鼠，连续7 d，制备MG患者血清被动转移模型。

2 改善T淋巴细胞免疫失衡机制的研究

雷公藤用于各种自身免疫性疾病的治疗已得到广泛认可，刘兰涛等[9]在研究雷公藤多苷时发现可降低EAMG模型大鼠胸腺T细胞受体（T-cell receptor，TCR）BVmRNA的表达，从而缓解EAMG症状。陈伟[10]研究人参皂苷Rb1（G-rb1）对EAMG模型大鼠影响发现其可通过上调CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量来缓解症状。朱洁等[11]研究表明升陷汤可能通过升高EAMG大鼠CD4+T淋巴细胞含量，降低CD4+/CD8+的比例，而起到治疗作用。吴周烨等[12]采用益气升提法治疗EAMG模型大鼠，发现其可提高CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，降低IFN-γ、IL-17含量，以减少神经肌肉接头处AchR损害。张运克等[13]研究显示补脾益肾起痿汤通过影响辅助性T细胞平衡，拮抗炎症反应，减轻肌无力症状的作用。徐鹏[14]根据王健教授提出的健脾益气补髓方进行EAMG动物实验，结果表明健脾益气补髓方可抑制EAMG大鼠CD4+T细胞、Th17细胞、Thl细胞分化数量，上调Th2细胞、Treg细胞分化数量，改善了Thl/Th2/Thl7细胞免疫失衡。

3 改善B淋巴细胞免疫失衡机制的研究

许梦贤[15]阐述益气升提法治疗EAMG大鼠的作用机制既通过下调CD4、上调Foxp3的表达影响T淋巴细胞，减少AchR-Ab的产生，又通过上调CD19的表达，减少IL-10的表达水平，影响B淋巴细胞群，改变B淋巴细胞系的平衡。

4 调节细胞因子分泌机制的研究

金硕果等[16]研究瘫痿胶囊发现，与模型组比较，瘫痿胶囊可显著下调EAMG小鼠外周血清中高表达的白细胞介素4（IL-4）水平，使EAMG小鼠外周血清中转化生长因子-β（TGF-β）表达水平较模型组水平升高，结果表明瘫痿胶囊治疗EAMG机制可能是通过下调血清中细胞因子IL-4，上调TGF-β水平，改善免疫耐受等，进一步改善EAMG小鼠的临床症状。牛凤云[17]认为MG基本病机为脾胃虚损、气血亏虚，治疗应遵循健脾补气、升阳益损，临床应用肌力康饮中药复方治疗MG，实验研究[17]表明肌力康饮降低EAMG大鼠血清中AchR-Ab的水平，与模型组比较肌力康饮各剂量组中EAMG大鼠血清中TGF-β水平明显升高，说明肌力康饮有助于TGF-β的提高，从而达到治疗作用。李春红等[18]基于温肾活血、益气升清的理论基础，提出益筋方对实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）小鼠的治疗作用在于可显著降低白细胞介素2（IL-2）的表达水平，从而增加EAMG小鼠体质量，减轻症状。邵锦根等[19]应用复方参芪合剂干预EAMG大鼠，研究指出复方参芪合剂能改善EAMG病情，其机制可能为下调干扰素-7（IFN-7）、白细胞介素4（IL-4）的比例，上调白细胞介素10（IL-10）的比例而使T细胞分化趋于平衡。张新欣等[20]发现小剂量的青蒿琥酯明显降低肿瘤坏死因子TNF-α细胞的数量，抑制TNF-α的分泌表达，延迟免疫应答的同时增强免疫耐受，已达到治疗疾病的作用。王洪峰等[21]研究发现“温阳补气”针法治疗EAMG机制在于降低EAMG大鼠血清IL-12和IL-18的表达水平。邹莹等[22]根据裘昌林教授的经验对马钱子胶囊治疗MG作用开展大鼠实验研究，其可能通过调节EAMG大鼠血清中TGF-β水平改变机体免疫抑制和激活的稳态，改善EAMG大鼠的免疫功能。邓锴等[23]运用况时祥教授提出的补脾强力复方治疗EAMG大鼠发现补脾强力复方能有效降低EAMG大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17水平，升高TGF-β水平，从而纠正EAMG大鼠Th1/Th2/Th17细胞因子失衡。

5 改善骨骼肌、线粒体、神经肌肉接头处超微结构的研究

刘友章[24]根据因地制宜、“南药治南病”的指导思想，总结出健脾祛湿方，实验研究表明该方不仅可使电镜下观察到的EAMG大鼠肌肉肌纤维稀疏、紊乱、线粒体减少的超微结构得以改善，同时健脾祛湿方还可改善EAMG大鼠神经肌肉接头处的皱折局部紊乱、溶解、消失，突触前膜囊泡减少等状态。胡芳玉[25]，雷孝文[26]依据团队“脾-线粒体”相关学说开展实验研究，发现健脾益气法治疗EAMG模型大鼠后，其骨骼肌、线粒体及神经肌肉接头处超微结构均得到明显改善，并且可明显调节线粒体相关通路蛋白过氧化物酶增殖激活受体γ-辅助激活因子-1α（PGC-1α）、细胞核呼吸因子1（NRF1）及线粒体转录因子A（Tfam）的mRNA表达，以此改善EAMG症状。

6 小结与展望

中医药治疗EAMG机制的研究，最多的是从调节促炎或抑炎细胞因子分泌的角度出发，包括可降低促炎因子 IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、TNF-α 等的表达水平，升高抑炎因子TGF-β、IL-10的分泌。而这些促炎或抑炎细胞因子都是由T细胞不同亚群分泌的，故有研究从调节Thl/Th2/Thl7/Treg细胞免疫平衡方向探究中医药的作用机制。重症肌无力是由T细胞介导和B细胞依赖，细胞和体液免疫均参与的自身免疫性疾病[27]，自身抗体应答主要由CD4+T细胞分泌的细胞因子调节B细胞产生抗体。CD4+T细胞可分化不同T辅助（Th）细胞亚群，包括Th1，Th2，Th17，T滤泡辅助（Tfh）细胞和调节性T（Treg）细胞，这些均已被证明参与MG和EAMG的发病[28]。在不同的Th细胞亚型中，Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、TNF-β，促进细胞介导的免疫应答，Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10，激活和维持体液免疫应答。Th17细胞产生IL-17、IL-18、IL-21、IL-22，在自身免疫性疾病的开始和发展中起关键作用[29]，Treg细胞通过抑制自体活性细胞的激活和增殖来调节Th和B细胞的免疫反应，因此对免疫平衡至关重要[30]。这四种Th细胞亚群的失衡被认为是导致MG和EAMG发病基本原因，而调节这些Th细胞亚群的分化及其分泌的细胞因子是治疗这种自身免疫性疾病的一个中药切入点，所以大部分中医药治疗EAMG动物模型的机制研究大多集中探讨调节细胞因子分泌，纠正Th1/Th2/Th17/ Treg之间的免疫失衡。

B细胞有双向调节作用，一些细胞因子如TGF-β、IL-10由B细胞分泌而来，TGF-β能抑制Th1、Th2细胞亚群分泌细胞因子，IL-10可抑制CD4+T细胞向下分化，进而调节自身免疫反应。CD19 是一种主要表达于B淋巴细胞膜上的跨膜蛋白，有助于B细胞抗原受体识别特异性抗原并激活B淋巴细胞，在已知研究中CD19+B细胞亚群可促进MG的发生发展[31]。现有的大部分中医药干预EAMG模型动物的研究大都局限在CD4+T淋巴细胞亚群分化平衡及细胞因子分泌抑制和促进上，仅有1项研究[15]在探讨中医药干预B淋巴细胞分化改善EAMG。MG是由自身抗原特异性B细胞产生的自身抗体引起的[32]。B细胞可呈递抗原，并分泌免疫调节细胞因子，从而在抗原特异性T细胞反应的调节中发挥重要作用，表现出深刻的免疫抑制能力[33]。B细胞和浆细胞还可以通过产生细胞因子，如IL-10、TGF-β或IL-35来抑制自身免疫性炎症[34]。诱导免疫抑制B细胞的分化可能是未来治疗MG的一个方向。

中医治疗重症肌无力一直遵循“治痿独取阳明”原则，脾弱则肉虚，脾是后天养护之根本，故现代医家皆从补脾，益脾，健脾为基本进行立法处方。依据“脾胃为气血生化之源”生理特点，有研究者从改善肌肉超微结构角度上阐述其治疗EAMG的作用机制，现代生物学上线粒体是能量代谢的始动环节，故从增加线粒体产生上研究中医药治疗EAMG的作用机制。“线粒体—脾”相关学说更贴近于中医基本理论源流，很好的将分子生物学机制与中医基础理论结合在一起阐述MG的发生发展及治疗靶向。

综上，大多中医药治疗实验性自身免疫性重症肌无力机制研究皆从调整免疫细胞分化平衡上立足，尤以改善Th1/Th2/Th17/Treg之间平衡最多，或在B细胞活化机制上，控制B细胞激活和增殖分化上进行机制研究。如何将中医特色理论充分地结合到分子生物学上阐述研究机制，将是我们中医学者思考和研究的方向。