微生物发酵中药的研究现状及其在养殖业中的应用

杨新波，张晓轩，蔡亚南，倪宏波，赵 权，马 赫

(1.吉林农业大学动物医学院，长春 130118；2.青岛农业大学动物医学院，青岛 266109)

微生物发酵中药(以下简称发酵中药)指用微生物处理中药材及其有效成分，将中药中的大分子物质转化成能被肠道直接吸收的小分子物质，制备成含有新的有效成分，或当前有效成分含量增加的中药制剂[1-2]。发酵法是中药炮制的传统方法，这种方法在中国最早的中药学著作《神农本草经》中便有记载[3]。直到现在，临床上也常使用发酵炮制的中药，如六神曲、建神曲、半夏曲、沉香曲等[4]。传统发酵技术是利用环境中的微生物在中药中自然发酵，由于环境的温度、湿度、酸碱度都无法精准控制，有时也会存在菌种不纯，影响发酵质量[5]。但随着现代微生态学、发酵工程等学科和技术的发展，现代发酵制药技术不仅克服了传统发酵技术发酵条件不可控的问题，更是可以根据发酵需求利用高纯度的单一菌种或是混合菌种进行发酵[6]，因此发酵中药在现代发酵技术的加持下能够标准化、规模化生产，这使得发酵中药制剂种类不断增加，质量也进一步提高，在畜牧、保健、化妆品等多个领域得到了更广泛的应用[3,7]。以下举例并阐述了发酵中药的优势，固体发酵、液体发酵、双向固体发酵的优缺点，以及发酵中药在畜禽养殖业和水产养殖业中的应用，讨论了发酵中药研究存在的问题及展望，旨在为发酵中药的深入研究提供思路。

1 发酵中药的优势

1.1 提高有效成分提取率

能用来发酵的中药一般是中草药，中草药中的有效成分大多在其细胞壁内，而植物细胞壁富含木质素、纤维素、果胶等致密结构成分，使细胞壁硬度增加且不易分解，阻碍了中药有效成分从胞内释出[3,8]。而通过微生物发酵所产生的胞外酶(如纤维素酶和果胶酶)可以一定程度地降解植物细胞壁，有助于中药活性物质的溶出。杨旭等[9]通过微生物固态厌氧发酵烟梗，发现乳酸菌降解纤维素最为明显，纤维素含量由20.83%降至15.90%；而芽孢杆菌可较好地分解木质素和半纤维素，木质素和半纤维素的含量分别由10.91%和10.66%降至5.55%和7.40%。金顺义[10]用含有产朊假丝酵母、干酪乳杆菌、粪肠球菌的复合益生菌发酵王不留行和益母草，结果表明发酵后的中草药有效成分均有不同程度地提高，如发酵中草药中的可溶性黄酮、生物碱、粗多糖、皂苷等有效成分较未发酵前分别增加了55.14%、127.28%、55.42%、49.21%。

1.2 降低毒副作用

许多中药虽然有很好的疗效，但毒性很大，利用发酵法可将中药毒副作用降低、减少不良反应[11]。传统中药雷公藤具有良好的免疫调节及抗炎作用，但因毒性较大严重限制了其在临床上的应用。何栾樱等[12]利用灵芝作为发酵菌种对雷公藤进行发酵，发现其主要毒性成分雷公藤内酯甲的准分子离子峰的峰强度由发酵前的184 028降低至123 972，说明经发酵后雷公藤内酯甲的含量减少，而雷公藤内酯甲含量减少与雷公藤的减毒作用直接相关。吴晓峰[13]比较了巴豆发酵品和其他巴豆炮制品及巴豆生品的物质基础及毒性，采用小鼠灌胃给药方式进行急性毒性试验，结果生种仁的半数致死量(LD50)是0.308 g/kg，而灭菌种仁和发酵品灵巴菌质、白巴菌质的LD50分别是0.728、1.541和1.495 g/kg，毒性分别下降了136.4%、400.3%和385.4%，可见发酵和其他炮制法均可使巴豆的毒性降低，而且发酵法减毒效果最佳。中药的毒性与其物质基础息息相关，为进一步阐明发酵法降低巴豆毒性的作用机理，作者利用重量分析法和考马斯亮蓝G250染色法对巴豆的毒性成分脂肪油及总蛋白进行含量测定，结果表明经发酵后，脂肪油及总蛋白含量明显低于生品及其他炮制品。并通过气相色谱法-质谱法联用技术(GC-MS)分析发现，脂肪油在整个发酵过程中共分离和鉴定出42种成分，其中相对含量在1.0%以上有11种，至发酵第32天时有6种成分与发酵刚开始(第0天)时相比含量有所增加，有5种成分则有所减少，且至少产生了8种新物质，说明巴豆发酵品与生品巴豆相比，脂肪油的种类和含量都存在明显差异，也初步解释了巴豆发酵品毒性降低的原因[13]，但是由于中药成分的复杂性，巴豆中脂肪油及总蛋白组成成分变化与其药效之间的相关性及其发酵品生物转化的机制尚不清楚，有待于进一步研究和总结。

1.3 产生新的有效成分

微生物代谢过程中产生的某些初级代谢产物和次级代谢产物能够与药材中的活性成分及非活性成分发生反应，形成新的前体化合物[3,8,14]。这为中药有效成分的合成及新活性物质的发现提供了新思路。李馨蕊等[15]从川芎内生真菌的发酵液中分离得到一个新的内酯化合物。Li等[16]用枯草芽孢杆菌发酵三七，发现在发酵过程中产生了一种抗肿瘤化合物人参皂苷Rh4，证明了微生物可以改变中药的物质组成，从而导致药效的改变。Chen等[17]从土大黄的共生真菌——尖孢镰刀菌ZZP-R1的发酵液中分离得到了2种新的化合物：Fusariumins C(1)和D(2)，这2种新型镰刀菌素分别对金黄葡萄球菌有较强和中等强度的抑制作用。张栋健[18]用传统的自然发酵法炮制枳壳，发现了3种新成分，分别为圣草酚-7-O-葡糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷和5-去甲基川陈皮素，其中圣草酚-7-O-葡糖苷具有较强的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除能力，5-去甲基川陈皮素具有多样的抗动脉粥样硬化的生物活性。越来越多的研究表明，利用中药的共生菌或者药用真菌来发酵中药材更容易产生新的活性物质，从而产生新疗效，但目前产生新成分的机理研究较少。因此探讨在一定发酵条件下，中药在此过程中的化学变化，以及因这些变化而产生的药理、毒理作用的改变和这些改变所产生的临床意义，才是发酵中药研究的核心和关键所在。

1.4 节约中药资源

随着国内外对中药资源需求的不断增加，中药产业规模也快速增长，但目前中药资源的利用度较低，中药渣废弃物对环境带来的挑战不容忽视[19]。据不完全统计，中国每年的中药材产量在7 000万t左右，而废弃中药渣在3 500万t左右，中药材利用率只有一半[20]。因此通过生物催化技术实现中药材的有效开发已成为必由之路，利用微生物发酵将废弃中药渣中的有效成分进一步释放，制成饲料或饲料添加剂可有效地对中药资源进行二次利用。倪亮[21]利用黏质沙雷氏菌发酵中药废弃物，制备得到了具有抑菌活性的灵菌红素，实现了废弃中药资源的有效利用。

2 中药发酵技术

2.1 固体发酵技术

固体发酵是指在没有或几乎没有自由水的条件下，以一定湿度农副产品为营养基质，以一种或多种菌种进行发酵的发酵技术，该发酵方法是从制曲工艺发展而来，后经改进优化形成[22-24]。

发酵中药的新活性成分除了中药本身化学成分的改变，还包括了微生物次级代谢产物[2]，而固体发酵更适用于生产次级代谢物，因为主要用于生产次级代谢物的微生物的菌丝形态非常适合在固体基质上生长[25]。固体发酵具有高转化、高产出的优点，与液体发酵相比，可提高终产品的浓度，固体发酵技术可以转化高达20%～30%的底物，而液体发酵技术最大仅能转化5%[26]。固体发酵由于耗水量低，减少了污水的产生，因此这种方法更加环保[27-28]。而且固体发酵对发酵设备的要求较液体发酵技术更为简单且易操作[29]。然而，固体发酵利用有机废物生产酶的一项研究指出，固体发酵方法会导致CH4、NO2和NH3等挥发性有机化合物的释放[30]。固体发酵是一种潜力巨大的发酵技术，不管是在微生物次级代谢产物和酶的生产上，还是在生物固体废物的降解或再利用上，几乎所有的报道都指出其相较液体发酵具有明显的优势。

2.2 液体发酵技术

液体发酵是指在适合的温度、pH、气体环境等条件下，以一定比例中药材提取液和液体培养基为营养基质，以一种或多种菌种进行发酵的发酵技术，这种方法来源于抗生素的生产工艺，也称为深层发酵[22,24]。

相较于固体发酵，液体发酵具有产物稳定性高、生产条件量化、可在线监测、自动化的优点，这使得它更适合于微生物产品的大规模工业生产[11,31-32]。而且液体发酵可以降低使用霉菌时真菌菌丝干燥的风险[33]，对可培养的微生物种类的限制也较少[25,27]。但是与抗生素相比，大多数中药的直接抗菌作用较弱，它们在发酵过程中容易受到细菌的污染，因此需要严格的灭菌要求[34]。在目前采用的液体发酵工艺条件下，中药中有效成分转化率低，相对成本高，存在一定的药材浪费[26]。此外，液体发酵的主要困难还有扩大菌丝培养[25]。虽然液体发酵是一种相对成熟的发酵技术，但是由于中药在发酵过程中容易被杂菌污染，并且有效成分转化效率较低，因此还需对液体发酵工艺及发酵设备进行优化。

2.3 双向固体发酵技术

双向固体发酵是在固体发酵技术的基础上衍生而来，它是以中药材替代传统营养基质，以一种或多种药用真菌进行发酵的发酵技术，其双向性在于具有活性成分的药性基质为药用真菌提供生长所需营养，同时药用真菌产生的酶又能改变药性基质原来的组织成分，使其产生新成分，具有新功效[35]。 双向固体发酵易产生新物质、新功效[34]，但因真菌与药材之间的不同组合，使发酵产物和化学成分变得复杂，而且药用真菌影响药性基质的机理不明确，有待进一步研究探索。

3 发酵中药在养殖业中的应用

中国是世界上最大的兽用抗生素生产国和使用国，而且中国近年生产的抗生素有一半用于动物饲料[36]。尽管抗生素的使用极大地促进了畜牧业的发展，但抗生素的滥用在动物体内造成大量残留物，并通过食物链转移耐药细菌和基因，对人类健康构成威胁[37-38]。为此2019年农业农村部第194号公告指出，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。因此寻找合适的抗生素替代产品，成为很多研究者和从业人员的关注点。许多研究表明，发酵中药具有提高动物生产性能、提高机体免疫力以及预防疾病的能力，可替代抗生素在养殖过程中的应用。

3.1 在生猪养殖中的应用

生猪生产在畜牧业经济中占有很大比重，是全球农业经济的支柱[37]。养猪业是抗生素滥用的重灾区，牲畜粪便占兽用抗生素排放量的42.6%，而猪粪便占牲畜粪便中抗生素残留量的98.7%[39]。微生物发酵中药作为一种饲料添加剂，能够降解抗营养因子、提高饲料的生物利用度、改善猪的胃肠功能、预防腹泻、提高猪的生产性能和健康水平，因此有望代替生长促进剂在生猪养殖上的应用[40]。

3.1.1 降低仔猪腹泻率并提高生产性能 方磊涵等[41]用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌发酵白术、秦皮等中药制成的发酵中药饲喂仔猪，发现基础饲粮组仔猪腹泻率为5.58%，而发酵中药组为2.65%，此种发酵中药能够降低仔猪腹泻率。 王坤丽[42]用乳酸菌发酵清瘟败毒散提取液制成的发酵中药饲喂断奶仔猪，即使是最大稀释倍数组，较对照组断奶仔猪的采食量(对照组587.8 g，发酵中药400倍稀释组648.9 g)、平均日增重(对照组297.5 g，发酵中药400倍稀释组345.8 g)也显著提高，腹泻率显著降低(对照组31.2%，发酵中药400倍稀释组17.4%)。

3.1.2 增强怀孕母猪的繁殖性能 郭宏伟等[43]用乳酸菌发酵生乳散(黄芪、当归、益母草等)制成的发酵中药饲喂妊娠母猪，结果表明服用生乳散和发酵生乳散的母猪较对照组平均窝产活仔数分别提高了4.46%和14.55%，平均窝死胎数分别降低了14.44%和55.61%，仔猪断奶重分别提高了9.83%和16.34%，显然发酵生乳散相比于生乳散对母猪的繁殖性能和仔猪健康状况有显著提高与改善。金顺义[10]用产朊假丝酵母、干酪乳杆菌、粪肠球菌发酵中草药(王不留行、益母草)制成发酵中药制剂，作为饲料添加剂饲喂泌乳母猪，提高了泌乳母猪的采食量、免疫力及泌乳力，显著提高了仔猪的断奶成活率和断奶均重。

3.1.3 提高育肥猪的生产性能与胴体品质 葛如兴等[44]用酿酒酵母菌等益生菌发酵含有党参、黄芪等中药材的营养基质，饲喂育肥猪，试验组的免疫因子浓度和免疫细胞浓度均显著高于对照组，同时瘦肉率和胴体重也均高于对照组，说明这种发酵中药具有提高育肥猪免疫力和改善胴体性状的功效。张治家[45]用嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌发酵黄芪、山楂等中药制成的发酵中药，同抗生素和基础饲料饲喂育肥猪相比，抗生素组和发酵中药组的平均日增重比基础饲料组分别提高了4.1%和20.5%，腹泻率分别下降了57.1%和71.4%，说明发酵中药和抗生素在提高育肥猪生产性能和降低腹泻率方面效果显著，而且发酵中药的效果优于抗生素。

3.2 在禽养殖中的应用

禽常患禽大肠杆菌病、坏死性肠炎以及由沙门菌或梭状芽孢杆菌引起的疾病，这些疾病是家禽养殖中的一个主要问题，造成了巨大的经济损失[46]，这类肠道感染多以抗生素防治[47]。目前发酵中药在禽养殖业中的应用研究多集中于防治禽大肠杆菌病，提高肉禽的生长性能以及防治新城疫。

3.2.1 提高肉禽的生长性能 李雪雁等[48]用乳酸菌发酵中草药饲料添加剂(黄芪、淫羊霍、甘草等)制成的发酵中药饲喂广东麻黄杂雏鸡，4～5周后发酵中药组平均重289.98 g、料重比为3.27∶1，对照组平均重240.89 g、肉料比为3.58∶1，说明该发酵中药制剂提高了雏鸡生长性能，降低了料肉比。汪鹏等[49]用枯草芽孢杆菌发酵中药健鸡散，饲喂白羽肉鸡，健鸡散组和发酵健鸡散组较对照组平均体重分别提高了4.6%和13.1%，可见发酵健鸡散和未发酵健鸡散均能提高肉鸡生产性能，而且发酵后效果更好。

3.2.2 防治禽大肠杆菌病 金海林[50]用保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌发酵中草药(黄芩、金银花、大青叶等)制成发酵中药饲喂大肠杆菌病理模型鸡，感染组的十二指肠分泌型IgA含量为76.63 μg/mL，十二指肠绒毛破坏严重，发酵中药组的十二指肠分泌型IgA含量为45.78 μg/mL，十二指肠绒毛完整，说明这种发酵中药对鸡大肠杆菌有良好的抑制效果。顾艳丽等[51]用植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母发酵中草药(穿心莲、白头翁、败酱草等)制成发酵中药液饲喂患大肠杆菌病模型鸡，发酵中药高剂量组、中剂量组和抗生素组的死亡率分别为20%、23.4%和20%，而治愈率分别为80%、70%和70%，说明中剂量发酵中药液抗菌效果明显，高剂量发酵中药液效果优于抗生素。

3.2.3 防治新城疫 黄迪海[52]用鸡肠道乳杆菌发酵金栀板青溶液(金银花、栀子、板蓝根)制成的发酵中药，分别饲喂攻毒(新城疫病毒)前SPF公鸡和攻毒后SPF公鸡，死亡率分别降低了60%～70%和52%～60%，说明金栀板青发酵溶液具有防治新城疫的效果。张桂枝等[53]用枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母发酵由黄芪、茯苓、党参等组成的复方中药，饲喂1日龄的肉鸡，结果基础饲粮组、基础饲粮+LPS组、基础饲粮+LPS+1%发酵中药组的新城疫抗体效价指数分别为4.50、3.50、5.50，说明这种发酵中药能有效地缓解脂多糖(LPS)应激对雏鸡免疫功能的影响，并显著提高了新城疫抗体效价。

3.3 在反刍动物养殖中的应用

发酵中药在反刍动物上的应用较少，目前主要集中于疾病的预防。王飒爽等[54]用酵母菌和黑曲霉菌等复合菌剂发酵党参、黄芪、白术等中草药，饲喂成年隐性乳腺炎奶牛，试验52 d，乳腺炎试验组奶牛乳中体细胞数量从53.45×104/mL降到23.25×104/mL，而乳腺炎对照组则从52.17×104/mL升到66.89×104/mL，说明这种发酵中药能显著降低隐性乳腺炎奶牛的体细胞数量。梁文军等[55]发明了一种由乳酸菌发酵姜半夏、陈皮、茯苓等中草药的发酵中药制剂，饲喂患乳房炎的奶山羊，试验组的乳房炎治愈率在85%左右，对照组为45%左右，说明这种发酵中药在防治山羊乳房炎上有良好的效果。

3.4 在水产养殖中的应用

水产养殖是提供可食用蛋白质的可持续农业生产模式之一[56]。水产养殖产量在过去20年中保持持续增长[57]，这得益于半集约化或集约化水产养殖方法以及抗生素的使用[58-59]，但也导致了养殖水产品中抗生素残留和细菌耐药。目前也有关于发酵中药作为饲料添加剂在水产养殖中应用的研究。

3.4.1 提高生长性能 孙艳霞等[60]用乳酸菌发酵的中药发酵膏饲喂南美白对虾，0.4%中药发酵膏组的成活率为90.48%、增重率为1944.1%，对照组成活率为61.19%、增重率为1068.2%，该中药发酵膏可以显著提高南美白对虾的生长性能。赵倩等[61]用枯草芽孢杆菌发酵黄芪、甘草、板蓝根等制成的发酵中药饲喂鲤鱼，2%发酵中药组的增重率为210.69%、饲料系数为1.6，对照组的增重率为172.7%、饲料系数为1.94，可见该发酵中药2%的添加量可以显著提升鲤鱼的生长性能。

3.4.2 优化肠道菌群 孙艳霞等[60]研究发现，发酵中药膏显著影响了南美白对虾的肠道菌群结构，0.4%中药发酵膏组的乳酸菌总数为12×106CFU/g、弧菌总数为1.4×106CFU/g，对照组的乳酸菌总数为1.3×106CFU/g、弧菌总数为14.4×106CFU/g，益生菌乳酸菌数量增加，致病性弧菌数量减少。赵倩等[62]用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌分别发酵黄芪、甘草、板蓝根、枸杞等制成发酵中药饲喂鲤鱼，发现以鼠李糖乳杆菌发酵中药组肠道菌群最丰富，与其他各组比较相似性最低。

3.4.3 防治疾病 谢炎福等[63]利用米曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和嗜酸乳杆菌作为复合发酵菌种发酵大黄、板蓝根、黄芩等复方中药制成发酵中药，饲喂出血病澎泽鲫，2%发酵中药预防组较阳性对照组成活率提高75%，治疗组成活率提高65%，显示发酵中药对嗜水气单胞菌引起的鲫鱼出血病均有明显的预防和治疗作用。

4 展 望

近年来，随着国家饲料禁抗政策的实施，为中药在畜牧行业中的扩大应用提供了重要的机遇，中药在畜牧业绿色发展与健康产业、减抗、替抗以及在产业转型中发挥着重要作用。但目前兽用中草药制剂生产大多停留在初级阶段，生产方式较为单一粗放，存在使用剂量偏大、有效成分难以溶出、中药资源利用度差等弊端，影响了其在兽药及饲料添加剂市场上的竞争力，因此通过生物催化技术实现中药材的有效开发已成为必由之路。越来越多的研究表明，发酵中药制剂可协同中药与微生物的优势与特长，在调节动物肠道微生物、提高动物生产性能、增强动物机体免疫力等方面具有显著疗效。因此发酵中药制剂作为兽药或饲料添加剂在养殖业中将得到更广泛的应用，具有广阔的应用前景及市场价值。

但是，目前发酵中药的研究仍处于起步阶段，对于其作用机理及物质基础的研究仍相对匮乏：①发酵中药的物质基础还相对未知，目前研究多集中于已知活性成分含量的变化，对于生成的新物质研究较少，虽然对发酵前后物质基础的研究难度较大，但只有全面了解中药发酵前后理化性质和药理作用的变化，以及产生临床意义的改变，才能对发酵方法作出科学的评价，指导和促进发酵工艺的改进，以及制定相应的药品质量标准，对发酵方法的发展具有极其重要的意义。②目前应用的微生物仅占已知微生物种类的一小部分，因此大量可用菌株仍有待挖掘，尤其是中药共生菌、药用真菌以及针对靶动物肠道微生物筛选出的有益菌株。如通过宏基因组和培养组等多组学联合，筛选与猪肠道消化特点和屏障保护相关的特异性菌株，通过这些主要优势菌群发酵中药，可起到对患病猪肠道菌群精准调控的作用。③发酵机理，即活性成分和转化产物之间的转化机制尚不明确，因此缺乏能代表中药功能的成分和药理指标，也限制了最佳发酵条件的制定以及发酵工艺的改进和发展。④发酵中药成分复杂，大部分发酵中药的药理作用机制尚不明确，如果将实验药理学和毒理学方法与化学方法结合起来研究发酵中药，可使化学研究更注意活性物质发酵前后的改变，使其研究的针对性更强，更能体现发酵方法的本质。⑤发酵技术仍相对处于探索阶段，暂时缺少稳定的产业技术体系和行业标准，因发酵技术有微生物的参与，更应该关注其卫生学检查，例如细菌总数、霉菌总数及黄曲霉毒素等的限量检查。因此应采用现代科学手段建立科学化、客观化的质量标准，以更好地保证发酵品的质量安全、稳定及可控。

随着菌种选育、生物发酵等技术的进一步发展，发酵中药的物质基础、药效学及药动学等数据的进一步完善，相信上述发酵中药相关问题也会逐步得到有效解决，这对发酵工艺的规范化、发酵中药质量标准化、管理现代化及发酵技术的发展具有重要意义，也将进一步加快发酵中药制剂的产业化进程，实现中药资源的可持续利用，以及开发安全、有效、经济、质量可控的替抗药物，符合无抗生态养殖的发展要求，具有重要的科学意义和社会价值。