饮水中添加复合益生菌对岭南黄羽肉鸡生长性能和肠道微生物菌群结构的影响

刘 石，刘 静，2，陈 庄，俞 婷，贝锦龙，王 蕾，李拯民，王志林

(1.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，广州 510640；2.华南农业大学动物科学学院，广州 510642；3.江门新会浩田生物科技有限公司，江门 529000)

肉鸡的中大鸡阶段是疾病的高发时期，如何高效低成本地控制集约化养殖带来的疾病风险和提高动物生长性能成为十分重要的问题。在过去很长一段时间内，饲用抗生素发挥了重要的作用[1-2]，然而，基于对公共卫生的考量，中国已限制促生长类药物添加剂在饲料中使用[3]。目前，依旧没有一种可行的产品能够低成本、高效率地替代抗生素在畜禽养殖过程中的作用，但国内外公认益生菌可能是最具潜力的替代品之一[4-5]。益生菌作为一种安全高效的微生态制剂，在动物养殖过程中已被广泛使用，如罗伊氏乳杆菌在育肥鸡阶段对肠炎链球菌感染具有潜在的益生菌活性，能提高回肠和盲肠乳酸菌的数量[6]；可通过增加JAM2和降低Claudin16的表达来增强肉鸡消化道紧密连接的功能和屏障功能，提高宿主对病原微生物的抵抗力[7]；罗伊氏乳杆菌产生的罗伊氏菌素具有极强的抑菌活性[8]。植物乳杆菌可以提高宿主肠道黏膜对大肠杆菌K88的抵抗力[9]，在肥育期或整个生长期采取益生菌干预优于仅在起始期的处理[10]。植物乳杆菌P-8可以在保持和抗生素相似生长性能的同时为肉鸡提供保护性免疫反应[11]。酿酒酵母可改善肠道形态结构，增强体液免疫功能，其保护作用可能与抑制TLR4通路及增加肠道微生物多样性有关[12]，其细胞壁成分可以显著提高小鸡的生长性能，同时对动物肠道谷胱甘肽途径、蛋白水解酶活性和营养物质转运有一定的调节作用[13]。但鉴于不同菌株、配伍方式及使用方法等带来的未知问题，针对不同产品进行动物试验验证十分必要。鉴于此，本试验研究了饮水中添加复合益生菌对岭南黄羽肉鸡生长性能和肠道微生物组的影响，以期为开发推广复合益生菌产品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取270只21日龄健康快大型岭南黄羽肉鸡(母鸡)，平均体重(626.71±1.95)g，随机分为3组，每组6个重复，每个重复15只鸡，各组的平均初始体重无显著差异。各组饲粮分别为：对照组饲喂基础饲粮；抗生素组饲喂基础饲粮+300 g/t 15%金霉素和40 g/t 50%维吉尼亚霉素；益生菌组饲喂基础饲粮，同时在饮水中添加复合益生菌。

试验在广东省农业科学院-白云试验基地进行，试验鸡由广东省农业科学院畜牧所自繁自养。试验前做好鸡舍卫生和消毒工作，地面平养，自然光照加补光，每天光照24 h，自由采食与饮水，随时观察并记录鸡的采食和健康状况，试验期5周。

1.2 试验材料

复合益生菌：罗伊氏乳杆菌由广东省农业科学院基因中心微生物资源研究室分离鉴定所得，植物乳杆菌和酿酒酵母均购自广东省微生物研究所。3种菌种按1∶1∶1的比例配制成复合益生菌，各菌种添加量参考实验室前期研究数据，均为1.0×106CFU/mL，总活菌数量为3.0×106CFU/mL。饮水添加。

试验饲粮：选用玉米-豆粕型基础饲粮，参照NRC(1994)建议的鸡的营养需要量、《鸡饲养标准》(NY/T 33-2004)和《中国饲料成分及营养价值表(2005年)》，按照22～42和43～56日龄2个阶段进行饲粮配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 样品采集与处理

在42和56日龄时，每组每个重复随机挑选出1只与该组平均体重相似的鸡，颈椎脱臼处死后，采集回肠和盲肠内容物，装入已灭菌并做好标记的2 mL EP管中，置于液氮中，待样品采集完后带回实验室，-80 ℃保存备用。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能 在42和56日龄时，分别以重复为单位称取鸡的空腹重(称重前禁食12 h，不禁水)，并记录耗料量。分别计算各阶段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)，并以各处理组为单位计算死淘率。

平均日增重(g/d)=(结测体重-初测体重)/(试验鸡数×试验天数)

平均日采食量(g/d)=总采食量/(试验鸡数×试验天数)

料重比=总耗料量/总增重

死淘率(%)=(初期鸡数-末期鸡数)/初期鸡数×100%

1.4.2 肠道微生物菌群结构 采用Qiagen试剂盒提取回肠和盲肠内容物中的微生物DNA，检测其DNA的浓度及纯度，并调整到适宜浓度(D260 nm/D280 nm值为1.8～2.0)后进行PCR扩增，DNA文库制备，上机检测，高通量测序工作委托天津诺禾致源科技股份有限公司完成。测序结果进行微生物组Alpha多样性及肠道微生物丰度变化分析。Alpha多样性分析是针对一定区域内物种的多样性进行的统计分析，主要指标包括：Observed Species 指数、Shannon指数、Simpson指数、Chao指数[14]和Ace指数。

1.4.3 数据统计 试验数据用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析和t检验，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 饮水中添加复合益生菌对岭南黄羽肉鸡生长性能的影响

由表2可知，22～42日龄，不同处理组之间平均日增重存在显著差异(P<0.05)；各组间平均日采食量无显著差异；益生菌组和抗生素组料重比均显著低于对照组(P<0.05)。43～56日龄，各组间平均日增重、平均日采食量和料重比差异均不显著(P>0.05)。 22～56日龄，与对照组相比，益生菌组和抗生素组平均日增重均显著提高(P<0.05)，益生菌组和抗生素组之间无显著差异(P>0.05)，但益生菌组的平均日增重有超过抗生素组的趋势；各组间平均日采食量和料重比均无显著差异(P>0.05)；死淘率排列顺序为抗生素组>对照组>益生菌组，由于试验样本量有限，死淘率仅代表有这种趋势。

2.2 饮水中添加复合益生菌对岭南黄羽肉鸡肠道微生物菌群结构的影响

2.2.1 Alpha多样性指数 由表3可知，对于回肠微生物，42日龄时，抗生素组Observed Species指数、Shannon指数和Ace指数均显著高于对照组和益生菌组(P<0.05)，各组间其他指数均无显著差异(P>0.05)；56日龄时，抗生素组Observed Species指数、Chao指数和Ace指数均显著高于对照组(P<0.05)，益生菌组Chao指数显著高于对照组(P<0.05)。对于盲肠微生物，42日龄时，对照组和益生菌组Observed Species指数均显著高于抗生素组(P<0.05)，各组间其他指数无显著差异(P>0.05)；56日龄时，各组间各指数差异均不显著(P>0.05)。

2.2.2 肠道微生物菌群丰度变化 通过与数据库Silva132比对进行物种注释，并对不同分类层级统计发现，共有1 101个OTUs，其中数据库中可注释的OTUs数目为1 091(99.09%)，注释到界、门、纲、目、科的比例依次为99.09%、97.37%、95.10%、90.92%和82.11%。

2.2.2.1 基于门水平物种相对丰度 由表4可知，回肠门水平上，42日龄时，益生菌组厚壁菌门的相对丰度显著高于抗生素组(P<0.05);拟杆菌门和变形菌门的相对丰度均显著低于抗生素组(P<0.05)，但与对照组均无显著差异(P>0.05)。56日龄时，益生菌组厚壁菌门的相对丰度与对照组和抗生素组均无显著差异(P>0.05)，但抗生素组厚壁菌门的相对丰度显著低于对照组(P<0.05)；益生菌组拟杆菌门的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)，但与抗生素组间无显著差异(P>0.05)；益生菌组变形菌门和放线菌门的相对丰度显著低于抗生素组(P<0.05)，但与对照组间无显著差异(P>0.05)。

盲肠门水平上，42日龄时，各处理组在厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门的相对丰度上均无显著差异(P>0.05)；56日龄时，益生菌组厚壁菌门的相对丰度显著高于抗生素组(P<0.05)，放线菌门的相对丰度显著低于抗生素组(P<0.05)，但与对照组间均无显著差异(P>0.05)。

2.2.2.2 基于属水平物种相对丰度 由表5可知，回肠属水平上， 42日龄时， 各处理组在乳杆菌属的相对丰度上均存在显著差异(P<0.05)，即益生素组>对照组>抗生素组；益生菌组肠球菌属、肠杆菌科未确定菌属、拟杆菌属和别样杆菌属的相对丰度均显著低于抗生素组(P<0.05)，但与对照组间均无显著差异(P>0.05)。56日龄时，益生菌组乳杆菌属的相对丰度显著低于对照组(P<0.05)，但与抗生素组间无显著差异(P>0.05)；肠杆菌科未确定菌属的相对丰度显著低于抗生素组(P<0.05)，但与对照组间无显著差异(P>0.05)；拟杆菌属和别样杆菌属的相对丰度均显著高于对照组(P<0.05)。

盲肠属水平上，42日龄时，益生菌组乳杆菌属、肠球菌属和别样杆菌属的相对丰度均显著低于抗生素组(P<0.05)，但与对照组间均无显著差异(P>0.05)；链球菌属的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)，但与抗生素组间无显著差异(P>0.05)。56日龄时，益生菌组乳杆菌属的相对丰度显著高于对照组和抗生素组(P<0.05)；链球菌属的相对丰度显著低于对照组(P<0.05)，但与抗生素组间无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 饮水中添加复合益生菌对岭南黄羽肉鸡生长性能的影响

复合益生菌可通过改善空肠黏膜屏障功能和肠道形态，改善肉鸡的生长性能、养分存留率和血清抗氧化能力，改善肠道健康[15]。研究表明，复合益生菌可以促进白羽肉鸡消化器官的生长、脂类合成及氨基酸代谢[16]，显著提高青年白羽肉杂鸡体重[17]，饲料中加入1.5%复合益生菌制剂，可以提高22～42日龄肉鸡的平均日增重，显著降低料重比[18]。本试验结果与上述研究结果基本一致，在22～42日龄，益生菌组平均日增重显著高于对照组，平均日采食量则无显著差异，益生菌组和抗生素组料重比均显著低于对照组，而益生菌组和抗生素组之间差异不显著，这与李龙[19]的结果有高度的相似性；43～56日龄，各组间平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著差异，说明抗生素作用效果可能会随着黄羽肉鸡日龄增加而减弱，益生菌组呈现同样趋势，可能与43～56日龄肠道菌群结构相对更稳定有关；22～56日龄，与对照组相比，益生菌组和抗生素组平均日增重均显著提高，各组间平均日采食量和料重比均无显著差异;益生菌组全阶段死淘率为1.11%，远低于对照组和抗生素组，这一结果与Tarabees等[20]结果基本一致。 整体上看，益生菌组与抗生素组在生产性能指标上存在较大的相似性，说明益生菌在一定程度上可以达到抗生素促生长的效果。以上各研究中，虽然添加的益生菌种类略有不同，但都体现出相同的趋势，说明肉鸡饲养过程中添加复合益生菌可以起到良好的使用效果。

3.2 饮水中添加复合益生菌对岭南黄羽肉鸡肠道微生物菌群结构的影响

肠道是营养物质消化吸收的重要器官，对宿主健康和生产性能起着重要作用[21-22]。肠道微生物是影响肠道健康的最主要的原因之一，其数量约是宿主细胞的10倍[23]，它对宿主的胃肠道生理、生长性能和免疫系统等都存在积极影响[24]。肠道微生物通过竞争抑制和产生抑菌物质等方式，直接或间接地减少肠道中有害微生物的数量，且复合益生菌似乎显示出比单一菌株更大的功效[25]。因此，通过饲喂益生菌来增强肠道免疫力[26]、缓解养殖中的疾病问题[27]成为一种不错的选择。

给家禽饲喂益生菌可以增加肠道益生菌种类，减少致病菌种类[28]，可能原因是高剂量益生菌持续进入到肠道中，成为相对优势菌群，对其他菌种造成抑制，这也很好地解释了益生菌组在42日龄回肠和盲肠中群落多样性相对较低的原因。在抗生素作用方面，Choi等[29]研究表明，饲喂35 d含阿维拉霉素饲粮的肉鸡回肠和盲肠中的细菌群落产生显著变化，阿维拉霉素组回肠细菌多样性高于对照组，盲肠则相反，这一结果与本试验结果基本相同，回肠多样性在42和56日龄均为抗生素组最高，盲肠多样性在42日龄则呈现相反状况。Costa等[30]研究添加5种不同抗生素对肉鸡盲肠微生物区系的影响，结果表明，各处理组主要类群的相对丰度与对照组间差异不显著，这与本试验结果相反，可能与抗生素添加剂量和饲养日龄有关[31-32]，同时肠道微生物区系之间复杂的相互作用使菌群整体对抗生素的耐受能力不同，也会造成结果上的差异[33]。

De Cesar等[34]研究表明，通过饮水方式添加乳杆菌可以显著提高14日龄肉鸡盲肠中乳杆菌的数量，同时对盲肠中有益微生物和功能基因有促进作用，饲粮中添加植物乳杆菌能降低盲肠大肠杆菌数量，增加乳酸菌的数量[35]，这与本试验结果类似，益生菌组56日龄肉鸡盲肠中乳杆菌属丰度上升。Johnson等[36]通过对大数据的挖掘发现，梭状芽孢杆菌属、肠球菌属和肠杆菌科未确定菌属的丰度与肉仔鸡的生产性能呈负相关，因为这些群体中可能含有导致肉鸡疾病的典型细菌种类，如产气荚膜梭菌、盲肠球菌和禽致病性大肠杆菌等。本试验中益生菌组肉鸡肠球菌属和肠杆菌科未确定菌属的相对丰度在42日龄回肠和盲肠中呈现下降趋势，且22～42日龄阶段肉鸡生长性能与对照组相比显著提高，这一变化与Johnson等[36]结果高度一致，且也表现出了肠球菌属、肠杆菌科未确定菌属与生长性能的负相关特性。然而本研究重点考虑肠道中微生物的变化情况，没有分析肠道菌群与宿主功能基因的关联变化，后续可以进行深入研究。

4 结 论

饮水中添加复合益生菌能够改善22～56日龄岭南黄羽肉鸡的生长性能，同时还改善了42和56日龄岭南黄羽肉鸡回肠和盲肠的微生物菌群结构。