浅析代谢组学临床血清及血浆样本的采集与前处理方法

邱伟华，熊琴平，何志梅，夏立，吕尚

（1.江西省疾病预防控制中心，南昌 330029；2.江西中医药大学，南昌 330000）

代谢组学（Metabolomics）研究的主要内容是生物体系新陈代谢动态进程中代谢产物的变化规律以及应激后（用药、患病等）代谢产物随时间变化的情况，以期最终阐明生物体系的代谢途径并揭示机体生命活动代谢本质[1]。代谢组学目前已经成为了包括临床诊断[2]、早期疾病监测[3]、临床不良反应监测[4]、疾病生物标志物鉴定[5]、药物作用机制研究[6]等领域的首选研究手段之一，病理变化可以通过组织和生物体液样本中代谢物的异常变化来表现，临床代谢组学的一般研究过程见图1。

而在临床代谢组学中，血液样本是最常用的研究材料之一，其中主要包括血清和血浆[7]，而血液样本（尤其是大批量血液样本）的复杂性和多样性便成为了代谢组学，尤其是非靶向代谢组学的一项重大挑战。因此，血液样本的质量对于有效的诊断和适当的治疗决定，以及可靠的、结论性的研究结果来说是至关重要的。大批量血液样本的质量往往取决于高重复性的收集和处理标准操作程序（S tandard O perating P rocedures，SOP），一些血液样本采集或处理过程中的不规范操作（如采血方式不准确、样本运输延迟、储存温度不适当）会极大的影响血液样本的质量[8-11]。根据文献报道，不规范、不准确的血液样本前处理将会造成60%～80%的临床代谢组学测试误差[12-15]，但通常来说，人们往往会忽视血液样本前处理方法，而把测试方法或仪器参数当做误差的主要来源。更加重要的是，在进行代谢组学研究时，所使用的血液样本类型、采集方法和前处理方法应保持一致，以此才能够保证代谢组学分析的平行性和结果的科学性。

近年来基于代谢组学的血液样本分析技术水平和应用范围有较大提高和拓展[16]，应用包括研究人类疾病以定义病理生理过程和发现生物标志物、研究药物毒性和疗效、研究环境与基因型的相互作用(如营养基因组学，nutrigenomics)和脂质研究(脂质组学，lipidomics)[17]。但许多研究人员对样本分析前的变量控制重视程度仍然不够，这可能导致偶然误差的增加，降低结果的可靠性和科学性，并且混淆最终的研究结果（如代谢轮廓模糊等）。因此，应该制定详细实验设计和规范血液样本前处理SOP，并且严格执行，以此确保能够获得可信的结果。本文对影响代谢组学研究的血液样本分析前的变量进行了系统讨论。此外，本研究还提出了关于血液样本选择、采集程序、前处理程序和存储条件的建议，以供相关研究和SOP制定参考。

图1 临床代谢组学一般研究过程

1 血液样本的选择

血清和血浆样本均被广泛应用于靶向和非靶向代谢组学研究，两者相似但不完全相同。血清是自然凝血过程后残留的物质，其中的血细胞以及参与凝血的蛋白质已被清除；血浆是在用抗凝剂处理血液样本以防止凝块形成，通过离心除去细胞而得。这两种从血液中去除细胞的方法将导致代谢组略有不同。就代谢轮廓来说，两者的代谢物种类（峰数量）差异不大，而一些代谢物在两者中的浓度（峰面积）差异较大。选择血清或血浆开展代谢组学研究，取决于研究的目标代谢物类型以及检测方法，如：液相-质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）、气相-质谱联用 （gas Chromatography-Mass Spectrometry，GCMS）或核磁共振 （Nuclear Magnetic Resonance，NMR）。实际上，无论检测方法是LC-MS还是GCMS，血清和血浆样本在由主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）所得的得分图上都有明显不同[18-19]。Liu[20]等人以超高效液相-质谱联用（Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-MS)为检测手段，对不同的血清和血浆样本进行了代谢轮廓对比分析，在216个已鉴定的代谢物中，46%的代谢物水平存在显著差异（P<0.05），只有3个代谢物（蛋氨酸、乙酰肉碱、丙酰肉碱）在血清中水平较低。显然，血浆和血清的选择必须基于实际考虑，然而，考虑到血浆和血清中可能存在的样本组成差异，应注意确保在任何特定研究中只使用一种样本类型。笔者总结了近3年以来血浆与血清在临床代谢组学中的应用实例（见表1）。

1血浆与血清在临床代谢组学中近三年的应用实例

2 血液样本的采集

大批量、大规模代谢组学研究中最重要的一个部分就是正确的收集样本集。临床上采集血浆常用的抗凝剂有乙二胺四乙酸（EDTA）、枸橼酸（柠檬酸）盐以及肝素盐等。其抗凝血机制分别为：（1）EDTA是通过与血液中的Ca2+形成配位化合物，从而抑制凝血活性；（2）枸橼酸（柠檬酸）盐是通过与血液中的Ca2+形成可溶性的螯合物，从而使Ca2+失去凝血作用；（3）肝素与血液中的抗凝血酶III结合后能增强其抗凝血活性，并且同时能降低丝氨酸蛋白酶的凝血活性，从而阻止血小板的聚集。相应的，以上三种抗凝剂的一般选择原则为：（1）枸橼酸盐是机体内三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle，TAC）的中间产物，以其作为血浆抗凝剂会对代谢组学的测定结果造成干扰，如果研究内容包括与TAC相关的代谢通路和靶点，一般不建议选择枸橼酸盐作为抗凝剂[46]；（2）EDTA（盐）应用于NMR代谢谱时会产生很强的噪音信号[47]，而应用于LC-MS或GC-MS代谢组学分析时无此现象，因此在以MS作为代谢组学检测平台时，笔者建议以EDTA（盐）作为血浆抗凝剂；（3）肝素是2种多糖交替连接形成的大分子多聚体，因此肝素盐会在LC-MS代谢谱中产生严重的干扰信号[48-49]，但由肝素盐作为抗凝剂采集的血浆将含有更多的代谢物。就目前来说，血浆代谢物研究应采用何种抗凝剂依然没有明确的规范和建议。因此在收集血浆样本之前，研究者应该综合研究对象和检测技术类型对抗凝剂特点和局限性进行全面考虑，使其能够适用于整个研究过程，避免不必要的干扰。

血清样本在临床上的收集一般采用无添加剂（常规）和添加血清分离胶（快速）两种方法。无添加剂采血时，全血经过较长时间（30～60 min）自然凝固后析出血清；而添加血清分离胶（separate gel，高分子半固体疏水性胶体）与全血一同离心时，将形成三层：血清（上层）、血清分离胶（中层）及血细胞（下层）。如此，首先能够有效的避免溶血以及凝血时间不一致对检测结果带来的干扰，其次能够大大缩短样本收集时间，提高效率和样本品质。笔者将临床所用的采血管（含凝血剂或促凝剂）总结归纳于表2。

3 血液样本的前处理

表2 临床采血管分类及适用范围

血清或血浆样本的基质比尿液等其它生物液体样本更加复杂，尿液中的高分子量蛋白质的浓度要低得多。制备用于LC-MS或GC-MS分析的血清和血浆样本包括去除高分子量成分的步骤，一般为添加有机溶剂或混合溶剂沉淀这些成分，然后离心分离沉淀物和含有代谢产物的上清（去蛋白化）。甲醇（或根据需求添加内标物质制成内标甲醇溶液）与样品的体积比为4∶1时，在室温(15～20℃)下具有高效的蛋白质去除效果[50]，且使用简单，取其上清液可直接进行LC-MS分析；或取其上清液进行衍生化后进行GC-MS分析。常用的衍生化试剂有：MeOX （甲氧胺盐酸盐）[17，51]、MSTFA[N-甲基-N-（三甲基硅）三氟乙酰胺][17，52]、BSTFA[N，O-双（三甲基硅）三氟乙酰胺][53]等。样本与衍生化试剂的孵化时间、孵化温度以及衍生化试剂加入量等条件将根据样本和所用分析仪器的不同而有略微变化，用于非靶向代谢组学的孵化时间一般为各1.5小时，孵化温度为60℃，衍生化试剂需加入过量[54-55]。

4 血液样本的存储条件

在制备血清和血浆后，应将一定量的样本快速冷冻于-80℃，直至分析。Gika[56]等人对比研究了在-20℃和-80℃条件下生物样本中代谢物的变化程度：-20℃和-80℃存储的样本在6个月后代谢物的组成与0天时相比没有显著的变化。但Pottala[57]等人报道了部分脂质组代谢物如DHA和EPA的浓度在-20℃下存储3个月后会明显降低。

样本的稳定性与每一种代谢物都相关，若将-80℃中的血液样本直接置于室温条件下，温度的剧烈变化将会引起某些代谢物的变化。因此笔者建议血液样本应在-80℃存储前分装，避免反复冻融（不超过3次为宜，且需冰面操作），最佳情况是每个受试者收集多份血清或血浆样本，并仅使用一次。

5 结语及展望

5.1 临床血液样本的采集和预处理的规范性亟待加强 血清和血浆是综合性的生物液体样本，人体中许多不同部位的功能和表型都融合其中，可以体现为组织代谢的“代谢足迹”[56，58]。然而，这种综合性可以稀释来自身体特定部位的微小代谢变化，在这些情况下，组织样本可能更加适合代谢物发现(如：肝脏用于肝病的代谢组学研究)。血清和血浆含有成百上千的代谢物，据估计，人类代谢组包含7800种代谢物，其中不包括许多与肠道微生物群、脂质和药物代谢相关的代谢物[59]，因此可以反映机体内许多部位的代谢轮廓。

对于代谢组学检测的样本采集和处理方法，目前暂时没有通用的指导性规范，因此笔者推荐采用以下血液样本采集、预处理及存储条件：选择血清样本或EDTA/肝素锂抗凝血浆样本；去蛋白化试剂:样本体积比为甲醇∶样本=4∶1；用于GC-MS非靶向代谢组学的孵化时间一般为各1.5小时，孵化温度为60℃，衍生化试剂需加入过量；样本应当提前分装好，并置于-80℃冰箱存储，尽量避免反复冻融（不超过3次），如需分析脂质组代谢物，须在3个月之内送检。

5.2 应根据临床代谢组学实验的具体情况选择采集血清或血浆样本 笔者在总结了近3年以来血浆与血清在临床代谢组学中的应用实例后发现，由于血浆样本较血清样本具有更多的代谢物信息与更好的重复性[60]，因此常常用于研究与疾病（包括疾病的不同病程）相关的生物标志物或代谢轮廓（代谢谱）；但由抗凝剂所引起的基质干扰也可能掩盖血浆中某些浓度较低的代谢物[61-62]，故在研究临床用药或饮食干预后相关的生物标志物时，常常选择整体灵敏度更高的血清样本。因此，笔者建议在设计临床代谢组学的实验方案之初，应按照拟解决的关键科学问题和研究方向等实际情况，确定拟采集的临床血样种类，以此保证实验结果的科学性。

5.3 人类临床血液样本的代谢组学研究正从小规模向大规模拓展 人类血液样本的代谢组学研究通常有两种不同的方式[17]：（1）小规模：在控制良好的实验室或实验环境中进行，在此条件下，试验的随机变量可控，并且相对极端（如：给药、控制饮食等）。其优势是代谢组变化巨大，从而易于检测和分析。此策略的样本量可以很小，但结果仍然具有统计学意义。（2）大规模：分析平台、方法和技术的快速发展使研究从小规模控制扩大到大规模，从短时间内分析几十例样本的代谢组，扩展到长时间内分析数百、上千甚至几千例样本的代谢组。这种规模的扩大需要在参与者对研究设计、样本的收集和分析实验的设计方面进行详细规划，以便发现受试者队列中的细微差异，使后续的数据分析无偏倚且符合目的和要求。大规模人类临床血液样本代谢组学研究的特点是由不同个体间的生理机能、代谢状态、生活习惯带来的随机变量多[63]且不易控制，这一特点对临床样本的采集和处理提出了更高的要求，也正是这一特点使得大规模人类临床血液样本代谢组学研究的结果具有更高的普遍性意义和实际参考价值。