一种H9 亚型禽流感病毒的临床鉴定方法

张蒙蒙，姬星宇

（商丘美兰生物工程有限公司，河南商丘 476000）

禽流感（Avian Influenza，AI）是由正黏病毒科、A 型流感病毒引起的一种禽类疾病综合征。分为高致病性和低致病性2 种， 该病毒是分节段的负链单股RNA 病毒，在其传代过程中极易发生基因突变、基因重组等，尤其是在免疫压力等因素的作用下。 其中低致病性禽流感常导致家禽的呼吸道症状，生长发育受阻及产蛋下降，常引起大肠杆菌等合并感染，且H9 亚型是当前流行的主型，严重危害养禽业的健康发展。 临床毒株的分离鉴定及生物学特性研究， 为现有及在研疫苗研究提供基础材料和依据。

2022 年1 月， 河南省某鸡场发生疑似低致病性禽流感疫情，从病料中分离到1 株疑似H9亚型禽流感病毒毒株， 对分离到的病毒进行了鉴定。 现将该毒株的分离和鉴定总结如下。

1 材料

1.1 样品

河南省某鸡场病鸡， 由商丘美兰生物工程有限公司实验人员采集病料， 带回实验室进行分离和鉴定。

1.2 阳性血清

H9 亚 型、H7 亚 型、H5 亚 型、NDV 及EDS阳性血清，购于中国兽医药品监察所、哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.3 禽流感（H9 亚型）PCR 鉴定材料

1.3.1 主要试剂：RNA 病毒基因组提取试剂盒、RNA 反转录试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司、针对禽流感H9 亚型HA 基因设计如下引物：

上 游 引 物：5’-CTYCACACAGARCCAARGRRATG -3’； 下 游 引 物 ：5’ -GTCACACTTGTTGTTGTRTC-3’； 2×Taq PCR mix、超纯水、琼脂糖、TAE 等。

1.3.2 主要仪器：PCR 仪、恒温水浴锅、水平电泳仪、凝胶成像仪等。

1.4 SPF 鸡胚和鸡

均来源于北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.5 试验设施

所有实验操作均在生物安全柜中进行，所有SPF 鸡饲养在商丘美兰生物实验动物房隔离器内。

2 方法

2.1 病毒分离

取病死鸡肝脏、肺、气管及气管干酪样物质等样品，按照1∶2 的比例加入无菌PBS 液，加入双抗，组织被研磨后，反复冻融3 次，10000 转/分钟离心8 分钟后取上清， 经0.45 微米微孔滤器过滤， 按0.2 毫升/胚的剂量经尿囊腔途径接种10 日龄SPF 鸡胚。 置36℃～37℃恒温恒湿箱内培养。 每日照蛋，弃去24 小时内死亡的鸡胚。取培养48～72 小时的死亡以及存活的所有鸡胚，每胚取样测定红细胞凝集价。

2.2 病毒含量测定

将收集的鸡胚尿囊液用无菌PBS 作10 倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93 个稀释度，分别经尿囊腔内接种10 日龄SPF 鸡胚5 枚，0.1 毫升/胚，置36℃～37℃培养，24 小时以内死亡的鸡胚弃去不计，24～120 小时内死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚尿囊液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120 小时，取出所有活胚，逐枚收获尿囊液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶16 判为感染，按照Reed-Muench 法计算EID50。

2.3 病毒鉴定

2.3.1 血凝试验法鉴定 取收获的鸡胚尿囊液分别与NDV、H9 亚型、H7 亚型、H5 亚型及EDS 标准阳性血清中和，再作红细胞血凝试验，根据检测结果进行判定。

2.3.2 分子生物学鉴定

2.3.2.1 基因组RNA 的提取和反转录

禽流感病毒RNA 的提取， 参照TIANGEN DP315 RNA 提取试剂盒进行。

反转录： 先加入提取的RNA 模板、Oligo（dT）18Primer 和Water，nuclease-free，65℃反 应5 分钟； 然后放置在冰上， 再加入5×Reaction Buffer、Ribolock RNase Inhibitor （20U/微 升）、10mM dNTP mix 和 RevertAid M -Mμlv RT（200U/微升），总体系共20 微升，42℃反应60 分钟，然后70℃反应5 分钟终止，得到禽流感H9亚型病毒液基因组cDNA。 PCR 反应程序：95℃5 分钟；94℃1 分钟，55℃45 秒，72℃2 分钟；30个循环，72℃10 分钟。反应结束后，取PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

3 结果

3.1 病毒分离结果

病死鸡样品接种鸡胚后24 小时内无鸡胚死亡，且无细菌污染；收获的尿囊液能够凝集鸡红细胞，HA 平均效价为1∶256。

3.2 血凝试验鉴定结果

该病毒与鸡新城疫阳性血清、H5 亚型禽流感阳性血清、H7 亚型禽流感阳性血清和减蛋综合征阳性血清中和后，HA 效价均为1∶128，证明分离株均不能被上述4 种阳性血清中和；与H9亚型阳性血清中和后HA 效价0， 无血凝效价，证明分离样品能够被H9 亚型阳性血清中和中和。 综合上述试验结果， 初步证明该分离株为H9 亚型禽流感病毒。

3.3 RT-PCR 鉴定结果

经RT-PCR 鉴定得到针对HA 基因产物为496bp，这与实验设计的目的片段大小一致。 结果见图1。

图1 PCR 电泳结果

3.4 病毒含量（EID50）的测定

将H9 亚型禽流感病毒用无菌PBS 作10 倍系列稀释，10-7、10-8、10-93 个稀释度， 各经尿囊腔接种10～11 日龄SPF 鸡胚5 枚， 每胚0.1 毫升，置36℃～37℃继续孵育，接种24 小时内死亡的鸡胚弃去不计，在24～120 小时内死亡的鸡胚随时取出，至120 小时，取出所有活胚，逐枚收获鸡胚液，每胚分别测定红细胞凝集价，红细胞凝集价不低于1∶16 者判为感染， 按Reed 和Muench 方法计算EID50。 计算结果，该毒株病毒含量为108.83EID50/0.1 毫升。

4 结论

实验室分离的疑似H9 亚型禽流感毒株具有血凝性特性，HA 效价为1∶256， 病毒含量为108.83EID50/0.1 毫升；经血凝试验进行鉴定，该毒株能够被禽流感H9 亚型阳性血清完全中和，确定该毒株为H9 亚型禽流感病毒。