猪传染性胸膜肺炎病原的分离鉴定试验

2022-02-14冀威

畜牧兽医科技信息 2022年12期

冀威

（朝阳市动物疫病预防控制中心，辽宁朝阳 122000）

猪传染性胸膜肺炎由胸膜肺炎放线杆菌引起，又称猪接触性传染性胸膜肺炎，以呼吸道症状为主要表现形式，具有高度传染性。典型症状有出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎，急性型表现高死亡率。各年龄和性别的猪都易感，以6 周龄～6 月龄的猪常见，3 月龄仔猪易感性最强，死亡率可达到80%～100%。病猪和带菌猪是传染源，如种公猪和慢性经过带菌猪。空气飞沫传播和生物媒介传播是最主要传播途径。鸟和啮齿类动物可携带病原菌进行传播。本病季节性明显，和4～5 月每年9～11 月多发。饲养环境恶劣、转群、运输、通风、温度、湿度、密度等应激因素都是诱发本病的原因。本研究成功从朝阳某猪场病猪扁桃体和肺部分离到了一株猪胸膜肺炎放线杆菌，对病原进行分离鉴定，通过药敏试验，筛选出敏感药物并制定了适合本地区的综合防控方案，对本病的防控和治疗有一定积极作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料（1）病料：2021 年3 月份，朝阳某猪场3 月龄左右的猪出现精神沉郁，采食量下降，发热，皮肤发红，不愿不稳，不爱运动，个别呼吸困难，咳嗽，犬坐。耳、鼻及四肢皮肤呈蓝紫色淤青，呼吸困难张口呼吸，体温上升，出现典型症状短期内快速死亡。剖检可见肺脏表面有纤维素性附着物和出现紫红色肝样变，胸膜厚，胸膜炎症状明显。无菌采集肺、肝脾、肾、气管和鼻腔分泌物病料进行实验室检验。

（2）试剂材料：蛋白酶K、胰蛋白陈、SDS(十二烷基磺酸钠)、NAaC(醋酸钠)、冰乙酸、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、氯化镁、PEG 等为国产分析纯级产品。

（3）培养基：以牛脑心浸汁为基础，巧克力琼脂、绵羊鲜血琼脂、SS 琼脂、麦康凯、马丁肉汤培养基。

（4）试验动物：小白鼠在体重18～20g（5 只）；70 日龄健康猪3 头。

（5）主要仪器：离心机、恒温培养箱、净化工作台、振荡培养箱、冰箱、电热恒温水浴锅、微量加样器、普通光学显微镜、微波炉、培养皿、三角瓶等、一次性注射器若干。

1.2 实验方法

1.2.1 显微镜观察首先，将无菌采取的病料均匀涂在玻璃片上，并进行革兰染色，找到清晰视野通过显微镜观察菌体特点，并做好记录。

1.2.2 分离培养首先用0.01%V 因子巧克力琼脂培养基划线接种病料，实验室恒温37℃条件下进行细菌培养24h。挑取菌落革兰氏染色，观察细菌形态和染色特性。然后用10%牛血清和100μg/mLNAD马丁肉汤做培养培养上述可疑菌落进行分离纯化，实验室恒温37℃培养24h，麦康凯琼脂培养基同步接种该菌落，详细观察菌落特征。

1.2.3 培养特性纯化的菌株接种到普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、SS 培养基、添加V 因子血平板培养基、巧克力培养基上，于37℃恒温含有10%CO2条件下培养24h，观察结果。

1.2.4 NAD 依赖性试验含有马血清和NAD 营养肉汤和不含马血清和NAD 营养肉汤当作实验用培养基，37℃培养124h，记录结果。

1.2.5 卫星现象纯化后细菌接种到加辅酶A 胰蛋白胨划有葡萄球菌十字线大豆肉汤琼脂平板上，37℃培养24～36h。

1.2.6 CAMP 试验垂直划线可疑菌和金黄色葡萄球菌于血平板上，两条线尽量靠近37℃培养18～24h。若金黄色葡萄球菌和APP 划线交界处出现三角形或烟头状溶血带，可判定为疑似胸膜肺炎放线杆菌。

1.2.7 生化试验挑取纯化后的疑似菌，接种葡萄糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、靛基质、甘露醇、MR、VP、尿素酶、硫化氢生化试剂及微量生化鉴定管，生化培养基中分别加入NAD，待检菌接入其中，37℃培养18h。

1.2.8 血清学试验血清学实验采用琼脂扩散实验。（1）实验材料 APPI～12 型标准阳性因子血清做定性用诊断血清；酚水待检抗原。

（2）抗原制备将各型标准菌株和分离菌株分别接种于TSA 琼脂培养基，37℃培养24h，用PBS洗掉菌落，离心机5000r/min，10min 洗涤1 次，将上清晰弃掉，用68℃去离子水进行稀释混匀，再加入等体积的68℃平衡酚，68℃恒温进行水浴并进行搅拌20min。再进行冰浴冷却至4℃，离心机7000r/min，离心20min 获得水相。沉淀后再加入与第一次等量的68℃去离子水，重复上述过程。将两次水相均匀混合即得诊断分型抗原。

（3）琼脂扩散试验 1g 琼脂粉，100mLPBS 缓冲液，加入三角烧瓶加热至溶化，经高压灭菌加入终浓度为0.01%叠氮钠。用1%琼脂溶液制成3mm 厚琼脂板，待琼脂凝固完全，平板上打梅花孔，挑出中间琼脂块加入玻璃器皿中再用酒精灯加热融化封底。梅花孔中间孔加抗原，边缘各孔加注其他各型抗体。将准备好琼脂平板37℃恒温扩散。设立标准株抗原对照和阴性血清对照组。36h 观察记录。琼脂扩散试验出现沉淀线判定为阳性，相反则判定为阴性。

1.2.9 攻毒试验（1）小鼠试验将上述病原菌纯化悬浊液，注射到3 只体重18～20g 小白鼠腹腔内，剂量每只0.3mL，对照组2 只小白鼠腹腔注射0.3mL 无菌马丁肉汤培养液，24h 后观察小鼠状态，无菌采集死亡小鼠肺、肝、脾等涂片染色镜检。

（2）病例复制试验事先准备好的3 头健康猪随机分试验组2 头，对照组1 头。试验组将5mL分离菌株滴鼻，对照组5mL 灭菌的生理盐水滴鼻，同等条件下不同圈舍饲养并观察临床症状表现，实验组致死病猪立即进行解刨。同上述方法无菌采集病料进行细菌分离培养，观察不同组织器官中细菌分离情况。

1.2.10 药敏试验特制的牛脑心浸汁琼脂平板均匀涂上通过实验所得的胸膜肺炎放线杆菌的菌株，用镊子夹取不同药敏纸片贴于平板上轻轻压实，37℃培养18～24h，观察并记录药敏实验结果。

2 试验结果

2.1 形态染色特性采集病料通过革兰氏染色镜检发现革兰阴性，有荚膜，无芽孢的短小杆菌。

2.2 细菌分离及形态鉴定结果（1）纯化后菌体在普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、SS 培养基上均不能生长；巧克力琼脂培养基和血琼脂培养基上可以生长，可观察到透明、细小、米粒大小圆形露珠样粘液菌落，菌落直径约1～2mm；含有V 因子普通营养琼脂培养基上长出乳白色米粒大小特征菌落。

（2） NAD 依赖性试验结果：有在马血清和NAD 营养肉汤中细菌能生长，没有不能生长。

（3）卫星现象试验结果：待检菌在滋养菌生长线附近密集生长距离滋养线越远越稀疏最终消失殆尽的卫星生长现象。

（4）CAMP 试验结果：划有金黄色葡萄球菌十字线处呈现典型烟蒂状溶血带(分离菌与葡萄球菌协同溶血所呈现出的表象)。判定阳性结果即分离菌为CAMP。

2.3 生化试验结果通过生化实验分离菌能发酵木糖、葡萄糖、麦芽糖；山梨醇、甘露醇、靛基质、MR、VP 不能生长；尿素酶实验能分解尿素产生氨和CO2；蔗糖实验结果不确定；不能产生H2S。（见表1）。

表1 分离菌株生化实验

2.4 血清学实验结果标准阳性血清3 型出现沉淀线，其他阳性均无沉淀线出现，判定分离株血清型为3 型。

2.5 攻毒试验结果（1）试验组小白鼠活动变弱，被毛竖立蜷缩，呼吸加快，18h 时开始出现死亡，48h内全部死亡；对照组没有死亡小鼠。死亡小鼠采集肝、脾、肺病料涂片染色镜检可见大量革兰染色阴性短小杆菌。（2）攻毒后被感染仔猪先后出现不同程度的精神沉郁、食欲下降或者废绝，喜卧运动下降，喷嚏，发热体温41℃，张口呼吸，犬坐姿势，无毛少毛处如耳、鼻、腿、腿侧皮肤发绀，个别猪有腹泻症状。（3）解剖病死猪可见典型猪传染性胸膜肺炎症状，出现胸膜肺炎，打开胸腔有淡黄色液体流出，胸膜有纤维素附着，肺脏、横隔膜粘在一起界限不清，支气管内大量泡沫状液体，心包变厚有大量液体渗出，心内膜和外膜上可见纤维素样附着物，肝脏暗红色充血肿大，被膜紧张，表面有坏死灶。（4）接种猪血液、粪、器官中APP 的分离结果是肺脏和扁桃体中病原菌分离率最高，为6/6，心血、气管分泌物次之，未在肾脏和肠系膜淋分离到APP。

2.6 药物敏感实验结果用分离到的APP 进行药物敏感性试验，结果（见表2）。