海岛棉染色体置换系与陆地棉随机交配群体不同株系的黄萎病抗性分析

耿立格，鹿秀云，郄彦敏，王新栋，孙娟，牛雪婧，王丽娜

（1.河北省农林科学院粮油作物研究所/ 河北省作物遗传育种实验室，石家庄 050035；2. 河北省农林科学院植物保护研究所，河北 保定 071000）

棉花黄萎病为土传维管束病害，是世界性的重要棉花病害之一[1]。 国外报道棉花黄萎病致病菌为大丽轮枝菌Verticillium dahliae和黑白轮枝菌V.alboatrum，而我国棉花黄萎病仅由大丽轮枝菌引起[2]。 选育和利用抗病品种是控制棉花黄萎病最为经济有效的措施。

陆地棉Gossypium hirsutumL.和海岛棉G.barbadenseL.是世界上广泛栽培的2 个四倍体棉种[3]。 陆地棉丰产性好、适应性广，是棉花生产上主要的栽培种；海岛棉纤维品质优良，并具有光合效率高、抗逆性强（耐瘠、耐旱）、高抗黄萎病、抗螨等优点[4-5]。 整合海岛棉与陆地棉优异基因，实现种间遗传重组，创制出高产、优质、抗病、抗逆的棉花新种质，一直是棉花种质创新的重要研究课题。 陆地棉背景的海岛棉染色体置换系是利用陆地棉单体作母本与海岛棉染色体供体杂交，从杂交后代中通过镜检选择，经多代连续回交后，培育的单一海岛棉染色体置换的陆地棉系[6]。其中，携带抗黄萎病基因的染色体也能被置换。陆地棉背景的海岛棉染色体置换系，由于仅有1 对置换的海岛棉同源染色体或染色体片段， 基因组与陆地棉的遗传背景相近，可作为桥梁进行陆地棉品种改良，进而克服陆海杂种后代疯狂分离等不利因素。 因此，将其与优异陆地棉材料杂交是创制聚合海岛棉与陆地棉优异性状新种质的有效途径和方法[7-8]。

Jenkins 等[9]利用18 个海岛棉染色体置换系（受体亲本为陆地棉遗传标准系TM-1，供体亲本为海岛棉标准系3-79） 和3 个优异陆地棉品系SG747、PSC355、FM966 进行杂交，从F1开始，将全部花粉混合授粉（1 代随机交配记为C0），经过5 代随机交配获得随机交配群体RMBUP （random-mated barbadense upland population）-C4。利用特异性微卫星标记对RMBUP-C4 群体自交1 代获得的RMBUPC4S1 群体进行基因型鉴定，确认16 条不同的海岛棉染色体存在此群体中， 每个植株至少包含5 个海岛棉染色体置换片段。 RMBUP-C4S1 又经过4代自交获得RMBUP-C4S5。 该群体携带海岛棉基因，遗传多样性丰富；因此，通过鉴定评价其各种性状，可为棉花的资源研究和特色育种提供丰富的种质，具有较强的利用潜力[11]。

本研究针对具有陆地棉背景拥有海岛棉基因的RMBUP-C4S5 群体的148 个株系， 以强致病力大丽轮枝菌菌株为接种病原菌，采用温室苗期切根接种法和田间病圃成株期鉴定法评价其黄萎病抗性，以期筛选抗、耐黄萎病的新种质，进而为抗黄萎病的优异棉花种质资源研究和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试棉花材料为RMBUP-C4S5 的148 个株系，编号为鉴1～88、鉴90～107 和鉴109～150。该群体来源于美国农业部农业研究服务局农业遗传和可持续农业研究中心。

感病对照棉花品种为鄂荆1 号[12]，由河北省农林科学院植物保护研究所提供；抗病对照棉花品种为中植棉2 号[13]，由中国农业科学院棉花研究所中期库提供。

1.2 棉花黄萎病菌

供试强致病力大丽轮枝菌菌株为WX-1[14]，由河北省农林科学院植物保护研究所从河北省邢台市威县棉花病株分离并保存。

1.3 试验设计与方法

1.3.1苗期棉花黄萎病抗性评价方法。 （1）试验设计。 采用温室苗期切根接种法[15]，在河北省农林科学院植物保护研究所温室内进行。试验采用随机区组设计，设3 个重复（区组），每个重复包括148 个待测株系、1 个抗病对照和1 个感病对照品种。 （2）培育棉苗。 育苗基质为田园土与林下土混合物，二者按体积比1∶1 混匀后，经121 ℃间歇灭菌2 次，每次1 h，间隔1 d。 将灭菌的育苗基质装入书式育苗盒（32 孔，深度12 cm），装至育苗盒高度的三分之二时，浇透水。将供试棉花种子播于育苗孔中，每孔3 粒，半盒16 孔48 粒种子作为1 次重复。 出苗后定苗，每孔保留2 株健康棉苗。 在日光温室内培养，温度为20～28 ℃，光照条件为晴天自然光照，阴天开启补光灯。培育棉苗至2～3 片真叶时备用。（3）人工接种棉花黄萎病菌。 在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化黄萎病菌，将新活化的黄萎病菌接入马铃薯葡萄糖琼脂培养液中，25 ℃振荡 （180 r·min－1）培养5 d 后用4 层纱布过滤，收集孢子，用血球计数板检测孢子含量，并用灭菌水将孢子含量调至2×107mL－1，作为病原菌接种液，现配现用。 棉苗长至2～3 片真叶时，将育苗盒打开，在距育苗盒底部2.0 cm 处用剪刀剪断棉根，合上育苗盒，将育苗盒浸泡在已配好的孢子悬浮液（每盒2 L）中，40 min 后取出育苗盒，把育苗盒置于温室内继续培养。（4）棉花黄萎病调查方法。当感病对照棉花品种鄂荆1 号发病较重时（接种后40 d），按照石磊岩等[16]温室苗期棉花黄萎病5 级调查法，调查记载单株棉苗的发病等级，计算病情指数（病指，DI）。棉苗黄萎病分级标准如下：0 级， 健康棉株；1 级，1～2片子叶发病；2 级，1 片真叶发病；3 级，2 片及以上真叶发病或病叶脱落，仅剩心叶；4 级，全株枯死。 病指计算公式如下：DI＝[∑（dc×nc）/（4×nt）]×100。式中，dc为相应病级，nc为对应病级病株数；nt为总株数。

1.3.2成株期棉花黄萎病抗性评价方法。 （1）试验设计。 于2020－2021 年在河北省农林科学院植物保护研究所定兴县田间病圃， 对RMBUP-C4S5 群体苗期表现耐黄萎病的8 个棉花株系和随机选取的8 个感病株系，依据《棉花抗病虫性评价技术规范 第5 部分： 黄萎病》（GB/T 22101.5－2009）[17]进行黄萎病抗性鉴定。 2020 年田间病圃鉴定材料包括3 个苗期耐黄萎病株系、4 个感病株系，2021 年田间病圃鉴定材料包括5 个苗期耐黄萎病株系、4个感病株系，2 年均种植抗病对照和感病对照品种。 试验采用单行区，行长5 m，行距0.70 m，定苗时每行留20 株左右。 小区随机排列， 设置3 个重复。 播种时间为4 月底。 （2）棉花黄萎病调查方法。为了筛选出抗病性强的株系材料，在田间棉花黄萎病发生高峰期植株发病比较严重时（8 月下旬）进行病情调查， 每个重复调查单行全部棉株发病情况。 按照5 级标准进行棉株病情调查记录，并计算病指，计算方法同1.3.1。 田间黄萎病病株分级标准如下：0 级，健康棉株；1 级，病株显症叶片数占总叶片数的比例≤25%；2 级，25%＜病株显症叶片数占总叶片数的比例≤50%；3 级，50%＜病株显症叶片数占总叶片数的比例≤75%；4 级，病株显症叶片数占总叶片数的比例＞75%[17]。

1.4 黄萎病抗性评价指标计算方法

采用相对病情指数（相对病指，RDI）评价各株系的抗性水平，相对病指计算公式：RDI＝DI×K。其中K＝50÷感病对照实际病指，50 为规定感病对照品种的标准病指。

温室苗期、病圃成株期棉花抗黄萎病类型根据相对病指确定，按照全国统一标准[17]抗病类型划分为免疫（I）、高抗（HR）、抗病（R）、耐病（T）、感病（S）5 个级别，具体划分标准见表1。

表1 棉花抗黄萎病类型划分标准

1.5 数据处理软件和统计分析方法

利用Microsoft Excel 软件，对试验数据进行整理和图表绘制；利用SPSS 22.0 软件进行平均值等描述性统计、单因素方差分析、最小显著差数法多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 温室苗期黄萎病抗性鉴定结果

2.1.1RMBUP-C4S5 株系的黄萎病相对病指分布。 温室黄萎病抗性鉴定结果显示：感病对照鄂荆1 号病指为49.6，相对病指为50.0；抗病对照中植棉2 号病指为33.8，相对病指为34.1，抗病对照表现为耐黄萎病。 对148 个RMBUP-C4S5 株系的黄萎病相对病指进行统计分析，结果表明各株系黄萎病相对病指为30.0～89.1， 平均相对病指为52.9。其中：8 个株系对黄萎病表现为耐病， 相对病指低于抗病对照，占群体鉴定株系的5.4%；相对病指高于抗病对照低于感病对照的株系有57 个， 占鉴定株系的38.5%；相对病指高于感病对照的株系有83个，占鉴定株系的56.1%。

2.1.2RMBUP-C4S5 株系的黄萎病抗性差异分析。经统计分析，供试的148 个RMBUP-C4S5 株系苗期黄萎病相对病指变异系数为23.62%， 群体株系间相对病指存在极显著差异（表2）。 表明各供试株系对黄萎病的抗性具有较大的差异，可以从中筛选出对黄萎病抗性较好的株系。

表2 供试棉花RMBUP-C4S5株系间苗期黄萎病相对病指方差分析结果

2.1.3不同供试RMBUP-C4S5 株系的苗期黄萎病抗性水平。 供试的148 个RMBUP-C4S5 棉花株系中没有免疫、高抗、抗黄萎病的棉花材料。抗病对照品种中植棉2 号表现为耐黄萎病。供试棉花株系中相对病指高于35.0 的有140 个，表现为感病，占供试棉花株系的94.6%。 相对病指在20.0～35.0 的有8 个，即鉴32、鉴49、鉴59、鉴62、鉴78、鉴83、鉴84、 鉴85， 表现为耐黄萎病， 占供试棉花株系的5.4%，这8 个耐病株系的相对病指均低于抗病对照品种中植棉2 号（图1）。 而且统计分析结果显示，8个耐病株系和抗病对照中植棉2 号的相对病指差异不显著，说明苗期耐病的8 个株系对黄萎病的抗性和中植棉2 号相当。

图1 RMBUP-C4S5 苗期耐黄萎病株系和对照中植棉2 号相对病指的统计分析结果

2.2 田间病圃成株期黄萎病抗性鉴定结果

RMBUP-C4S5 群体苗期耐黄萎病的8 个株系、感病的8 个株系田间病圃成株期黄萎病抗性评价中，2020 年、2021 年感病对照鄂荆1 号病情指数分别为60.5、74.3， 抗病对照中植棉2 号病情指数分别为27.0、25.3。 2020 年、2021 年抗病对照中植棉2 号相对病指分别为22.3、17.0，2020 年表现为耐黄萎病，2021 年表现为抗黄萎病。 鉴定结果（表3）表明：8 个苗期耐病的株系中，鉴78、鉴85 成株期相对病指分别为14.3、13.0，均表现为抗黄萎病，鉴49、鉴83 仍表现为耐黄萎病，而鉴32、鉴59、鉴62、鉴84 则表现为感黄萎病；供试的8 个苗期感病的株系中，鉴19、鉴124、鉴143 在成株期表现为耐黄萎病，鉴13、鉴33、鉴37、鉴44、鉴140 仍表现为感黄萎病。 鉴78、鉴85、鉴49、鉴83 这4 个株系在苗期均表现为耐黄萎病，在成株期表现为抗或耐黄萎病，将是进一步研究的重点遗传材料。

表3 16个供试RMBUP-C4S5株系苗期和成株期的黄萎病相对病指和抗病类型

3 讨论与结论

本研究供试材料RMBUP 群体，是利用海岛棉染色体置换系创制的具有陆地棉背景携带有众多海岛棉基因、遗传多样性丰富的遗传群体。 任立华等[18]、Saha 等[19-21]、Wu 等[22]、栾 明宝 等[23-24]曾对创 制RMBUP 群体所使用的海岛棉染色体置换系开展农艺性状和遗传效应评价，Wu 等[25-26]研究了13 个染色体置换系种子的蛋白质含量和含油量， 钱能[27]、付央等[28]进行了一些农艺性状定位，McCarty 等[11]对随机交配不同世代的RMBUP 群体进行了农艺性状和纤维品质性状的评价。以上主要开展的是农艺性状相关的研究，没有进行黄萎病抗性分析。 本研究对以海岛棉染色体置换系创制的随机交配群体RMBUP-C4S5 开展了黄萎病抗性鉴定， 筛选优异的抗、耐黄萎病材料，对利用海岛棉优异抗病基因进行种质创新和品种改良具有重要意义。

国家棉花品种区域试验中黄萎病抗性鉴定采用人工成株期病圃鉴定方法[17]，对于批量棉花种质资源进行黄萎病抗性鉴定一般结合苗期人工接种黄萎病菌的方法进行[29-30]。中植棉2 号是2006 年国家审定的抗黄萎病品种。在本研究人工病圃成株期鉴定中，2020、2021 年中植棉2 号黄萎病病指分别为27.0、25.3， 相对病指分别为22.3、17.0， 表现为耐、抗黄萎病；苗期切根接种法鉴定中，中植棉2 号病情指数为33.8，相对病指为34.1，均高于人工病圃鉴定的相对病指。本研究供试的148 个RMBUPC4S5 群体株系中，苗期没有筛选出免疫和高抗、抗黄萎病的材料， 但苗期表现耐黄萎病的鉴78、鉴85，经成株期病圃鉴定为抗黄萎病类型。 推测其主要原因是苗期采用切根接种法鉴定，会造成棉花材料根部丧失抗侵入功能，选择压较大，发病较重。在已有的研究报道中也出现过类似的结果[31]。对成株期鉴定出的RMBUP-C4S5 群体抗黄萎病材料， 已经开展基因组研究，以期进一步确认此抗性是否来自于海岛棉。

大田生产中棉花常常在现蕾期出现黄萎病典型症状，一般在七八月份出现发病高峰。但近年来，棉花黄萎病发病时间明显提前，在5 月底或6 月初田间出现零星病株，较以往提前7 d 左右[32]。 因此，苗期棉花黄萎病抗性鉴定对于优异抗病种质资源筛选也尤为必要。

本研究通过对RMBUP-C4S5 的148 个株系进行黄萎病抗性鉴定，明确了群体各株系的苗期黄萎病抗性水平，筛选出4 个苗期耐黄萎病、成株期抗或耐黄萎病的株系鉴78、鉴85、鉴49、鉴83，有望成为棉花抗黄萎病种质资源研究和品种改良利用新的优异种质资源。