椴树属植物无性繁殖研究进展

林士杰， 王梓默， 朱红波， 何怀江， 勾天兵， 韩 姣

(1. 吉林省林业科学研究院， 吉林 长春 130033； 2. 吉林省林业调查规划院， 吉林 长春 130022)

椴树属(TiliaL.)隶属于椴树科，形态结构特殊，是该科中唯一典型的北温带分布属。分布在亚洲、欧洲和北美洲，相互分离，构成典型的三块独立分布格局[1]。椴树属植物为落叶乔木，全球约有80种，中国有30多种，其形态特征表现为花序或果序上着生着奇葩的大型苞片，这是其他所有科属植物都不具有的特征[2]。该属植物材质轻软，纹理通直，光泽而又富有弹性，是极好的用材树种。树形优美，叶大阴浓，花香馥郁，对烟尘和有害气体抗性强，是极佳的园林观赏树种，被誉为世界四大阔叶行道树之一[3]。同时，椴树属植物既是重要的蜜源植物，又具有较高的药用价值，是开发潜力极大的阔叶用材树种。

近年来，我国对椴树属苗木的需求量日渐增大，但因其种子具有致密的种皮、坚韧的果皮，严重影响了气体与水分的摄入，果皮、种皮以及胚乳中均存在抑制物质，导致椴树属植物具有不同程度的休眠性，种子发芽率低，参差不齐[4-10]，难以满足其种群的扩大[11，12]。同时，种子繁殖，后代会产生性状严重分离，而无性繁殖技术能够保持母本的优良性状，个体之间差异较小，是实现椴树属优质资源高效繁殖、稳定遗传的重要基础。但在无性繁殖技术方面有关椴树属植物的研究进展比较迟缓，笔者对国内外学者在椴树属植物无性繁殖方面的研究进行详细总结归纳，分析这些技术中存在的主要问题，提出一些合理化建议，旨在为椴树属优质资源快繁技术以及资源开发利用提供参考。

1 研究进展

椴树属树种传统的繁殖方法是以播种繁殖为主，但由于椴树属植物具有不同程度的休眠特性，自然条件下，经过2个冬季1个夏季后，种子才会陆续萌发，多数在自然状态下甚至更长时间才能萌芽，发芽率低，幼苗出土后参差不齐。同时，绝大多数树木实生繁殖方式不能保持植株遗传特性，而且易产生遗传分化，无性繁殖是有效保护、保存紫椴优良基因资源稳定性的最佳途径。国内外许多研究人员对椴树属树种的嫁接、扦插及组培繁殖技术进行了研究，并取得了一定的进展，但是，到目前为止，仍无法满足国内外市场对椴树属优良苗木的需求。

1.1 嫁接

嫁接繁殖具有能够保持母本个体的优良特性、固定变异、扩大繁殖系数、改变植株观赏形态等诸多优点[13，14]。姚盛智等[15]于1977—1986年对紫椴进行了4次嫁接对比试验，筛选出成活率在89 %以上的“贴接法”应用于生产，认为嫁接时间最好选在5月9日至5月15日之间；接穗应从原始母树林中采穗建立采穗圃，从采穗圃无性系分株上采集接穗进行嫁接，可大大提高嫁接成活率。李庆国等[16]以7种椴树属树种1年生枝条为接穗，2年生紫椴作为砧木进行劈接、芽接，结果表明，树种不同、方法不同，嫁接成活率也大不相同，其中以紫椴为砧木，小叶椴嫁接成活率最高，达81.25 %。砧木的选择对嫁接新品系的生长状况、结实品质以及抗逆性都会产生很大的影响[17-20]。刘云强等[21]以糠椴、蒙椴、紫椴为砧木，对大叶美洲椴、锥形银椴采用不同方式进行嫁接试验，总结表明，糠椴、蒙椴、紫椴作为砧木与大叶美洲椴、锥形银椴都具有较强的亲和力，嫁接成活率平均达85 %以上。这些研究为椴树属树种嫁接繁殖在生产应用中提供了一定的技术参考。

1.2 扦插繁殖

与嫁接、压条、埋条等方法相比，扦插繁殖技术具有诸多优点，扦插材料容易获取，操作简便易行，苗木生长速度也较快，成本低，并且能够保留亲本的优良性状[22-25]。影响扦插生根率的因素有很多，关键因子主要有以下几个。

1.2.1 植物生长调节剂(植物激素)

植物生长调节剂(植物激素)可以促进插穗生根，尤其对扦插生根比较困难的树种具有明显促进效果[26]，但其种类的选择、浓度以及浸泡时间对插穗生根的效果都会产生极大的影响。谢遵国等[27]、杨虹等[28]、吴小龙等[29]研究表明，IBA、NAA、ABT 3种植物生长调节剂对紫椴、泰山椴插穗生根具有明显的促进作用，嫩枝生根率显著高于硬枝。王文凤等[30]提出，不同浓度的IBA处理蒙椴2～3年生嫩枝不仅大大提高了插穗生根率，而且生根数量和根长也明显增加，生根时间也显著缩短。姚颖等[31]通过对3年生紫椴实生苗的半木质化插穗采用不同生长调节剂处理15 s，定期对比生根情况，结果表明，IBA的各个浓度处理生根效果都优于相同浓度的IAA、NAA处理，1 000 mg·kg-1的IBA处理生根效果最佳，生根率达到56 %。王海南等[32]采用不同浓度IBA、NAA、ABT，不同时间处理紫椴1年生新苗嫩枝，其生根情况对比分析表明，与NAA、ABT1处理相比，IBA能显著促进繁殖材料的生根率、生根量以及平均根长，最优组合为100 mg·L-1IBA处理8 h，生根率高达63.07 %，并提出各植物生长调节剂低浓度结合较长时间处理会显著影响嫩枝的生根数量和平均根长。

张晓曼等[33]、张芹等[34]将大叶金叶椴、糠椴嫩枝采用一定浓度的植物生长调节剂浸泡与发根农杆菌处理相结合，生根率及根长生长效果显著高于对照，生根时间大大缩短。

1.2.2 插条选择

扦插苗木的生长状况在一定程度上取决于母树年龄、插穗类型、插穗采集时间以及部位。谢遵国等[27]试验证实，母树年龄越高生根越难。王海南等[32]对比研究表明，1年生紫椴嫩枝插穗无论是生根质量还是生根率、生根量以及平均根长都明显优于2年生嫩枝插穗。杨虹等[28]、吴小龙等[29]提出，紫椴、泰山椴嫩枝生根率显著高于硬枝。张淑华等[35]试验证实，紫椴6月下旬采集插穗生根效果最佳。带有侧芽的插穗生根效果远远好于带有顶芽的插穗。吴小龙等[29]通过对泰山椴插穗不同部位、不同采集时间研究得出，选择8月上旬的半木质化枝条中段生根效果最佳。史锋厚等[36]通过对插穗留叶数量、插穗粗度对比研究，得出南京椴选择粗度0.55 cm以上的嫩枝制备插穗，保留一片叶片生根效果最佳。

1.2.3 基质及环境

基质不同，其透水性、通气性、保水性等功能特点也有所不同[37-40]，与扦插环境直接影响插穗生根部分的温度、湿度与插穗的水分平衡[41-43]，适宜基质及环境的选择是确保扦插生根率的关键因子，同时，利用半木质化嫩枝插穗进行扦插是开展繁殖困难树种规模化扩繁的重要途径[44，45]。王海南等[32]在温室内，以河沙、蛭石及珍珠岩+泥炭土(体积比1∶3)作为基质，采用自动间歇式喷雾，以1年生、2年生紫椴当年半木质化枝条中上部分制成插穗进行扦插，60 d研究结果显示，3种基质中河沙扦插生根率显著高于其他基质，在河沙上1年生枝条生根率平均为37.16 %，2年生枝条生根率平均为28.99 %。姚颖等[31]在插床上搭建拱棚，设置控温控湿设备，选用河沙、蛭石、河沙+蛭石(体积比1∶3)3种无机基质，将阔叶落叶、针叶落叶、蘑菇栽培废弃物、木耳栽培废弃物、树皮、稻壳、锯末和草炭8种材料按不同比例混合配置成43个有机混合基质，采用相同浓度生长调节剂处理3年紫椴实生苗的嫩枝插穗，统计结果显示，在无机基质中，河沙的生根率最高达51 %，在有机基质中，树皮+针叶，树皮+锯末，树皮+蘑菇栽培废弃物、针叶+树皮+草炭这4个混合基质生根率较高，其中树皮+针叶生根率最高达到60 %。史锋厚等[36]采用自动喷雾、自动遮阳和温控系统，在温室内以珍珠岩为基质，插穗采用1 000～1 500 mg·L-1IBA处理，生根率可达80 %。

1.3 组织培养

植物组织培养技术具有增殖倍数大、繁殖速度快、经济效益好等优点，而且不会因为场地和外界环境条件而受到局限。椴树属树种组织培养技术具有一定难度，最早进行椴树研究的是Barker，他从美洲椴的不同组织中诱导出了愈伤组织；Chalupa首次从心叶椴幼树腋芽中获得了分化的嫩芽；国内外学者又相继对椴树属树种组培再生扩繁技术进行研究并取得了一定的进展。椴树属树木离体快繁研究概况见表1。

表1 椴树属树木离体快繁研究概况

1.3.1 外植体

目前，开展离体再生繁殖的椴树属树种主要有美洲椴、心叶椴、日本椴、欧洲小叶椴、南京椴、紫椴。外植体的选择是椴树属树种组培再生体系建立成功与否的关键因子之一，到目前为止，椴树属树种选取的外植体类型包括腋芽、茎尖、叶片、根尖、无芽茎段、带腋芽的茎段、成熟胚、上胚轴。椴树以腋芽、带腋芽的茎段、成熟胚、上胚轴为外植体，能够成功诱导出丛生芽，而其他组织仅仅只是诱导出了愈伤组织，并且随着培养时间的延长，愈伤组织逐渐变成黑褐色，失去分化能力。这些研究表明，带芽茎段、成熟胚作为外植体，是椴树属树种丛生芽诱导的最佳选择材料。

1.3.2 培养基

日本尹阳等[46]选择IS、WPM、BTM 3种培养基添加不同浓度的BAP筛选适宜心叶椴腋芽萌发的培养基，结果表明，WPM培养基适宜诱导心叶椴腋芽萌发。日本尹阳[47]又在MS、IS中添加不同浓度BAP筛选诱导紫椴腋芽萌发的培养基，结果表明，MS培养基有利于诱导腋芽萌发，嫩枝形成率77.6 %。张建瑛等[48]选择WPM、1/2 WPM、MS 3种培养基添加一定浓度的BA、NAA进行带芽茎段诱导培养基的筛选，结果表明，带芽茎段在WPM培养基上启动率显著高于1/2 WPM、MS，启动时间显著快于二者，是诱导带芽茎段萌发的最佳启动培养基。

MS培养基适用于日本椴、欧洲小叶椴、紫椴丛生芽的增殖培养，WPM适合于心叶椴、紫椴腋芽增殖培养。日本椴、欧洲小叶椴、南京椴、紫椴生根多以1/2 MS为基本培养基，汤诗杰等[49]以MS为南京椴生根培养基，也成功获得生根苗。心叶椴以WPM为生根基本培养基。

1.3.3 植物生长调节剂

基本培养基中添加一定浓度的植物生长调节剂是树木组培再生体系能否成功建立的关键因子，植物生长调节剂在植物组织培养工作中占据至关重要的地位。目前研究显示，椴树属树种组培再生体系应用的植物生长调节剂细胞分裂素主要有6-BA、KT，生长素主要有NAA、IBA、GA3。从表1中可以看出，从腋芽诱导、丛生芽的形成、丛生芽的增殖培养以及诱导生根培养基的成功建立，并不是细胞分裂素或生长素独立作用的结果，而是二者在一定浓度范围内的相互协同作用促进了椴树属树种外植体组培再生体系的成功建立。单独使用6-BA时，南京椴不定芽分化率仅为25 %，并且茎很细，叶黄，出现玻璃化现象[50]。培养基中除6-BA、IBA外，添加一定质量浓度的GA3，不仅利于紫椴腋芽的伸长生长，而且增殖的不定芽数量增多，不定芽茎粗壮、叶子大[48]。适宜浓度的6-BA、NAA有利于南京椴、欧洲小叶椴、日本椴不定芽分化、增殖[50-52]。IBA、KT、GA3也被应用到了南京椴腋芽的诱导、增殖培养[49]。对于欧洲小叶椴[51]、日本椴[52]、心叶椴[46]，适宜质量浓度的IBA、NAA相互组合使用即可诱导正常生根[46，51，52]，而南京椴生根诱导过程中，除IBA外，培养基中还加入了一定量的6-BA[50]。

1.3.4 蔗糖、pH及添加剂

张建瑛等[48]试验证实，蔗糖质量浓度过低、过高对紫椴腋芽的增殖都会产生影响，20 g·L-1最为适宜。同时提出，培养基微酸性(pH 6.0～6.5)增生的腋芽饱满，长势良好，pH 5.5的酸性环境条件下腋芽增殖系数显著下降，叶片变得细长。南京椴生根培养过程中，MS培养基中添加活性炭，有助于不定根的诱导，与培养基中不添加任何物质相比，生根率提高了74.2 %，而且苗生长旺盛，粗壮[50]。

1.3.5 移栽基质及环境条件

组培生根苗移栽的成活率、长势是直接关系到能否实现椴树属树种苗木规模化生产的关键，到目前为止，椴树属树种组培苗移栽方面的研究主要包括基质、移栽后的温度、湿度。陈罡等[52]提出，日本椴生根苗在自然光下开瓶2～3 d，20～25 ℃清水冲洗根部，0.1 %代铵森浸根3～5 min，移栽至细河沙+珍珠岩(体积比2∶1)的混合基质中，每天早晚各喷水1次，成活率达到80 %。白卉等[51]在22～25 ℃，空气湿度为70 %～90 %的条件下，选用蛭石+壤土(体积比1∶1)的混合基质，移入经70 %甲基托布津药液消毒的欧洲小叶椴生根苗，成活率达75 %。南京椴移入泥炭土和河沙中，30 d后统计结果显示，生根苗在泥炭土中成活率较高，达80 %以上，而在河沙中成活率为60 %[50]。

1.4 体胚诱导

体胚发生技术已经成为木本植物快速繁殖的重要手段[53]。Gupta P K，Durzan D J，Smith D R[54-56]将体胚发生和植株再生技术成功应用到火炬松、挪威云杉、辐射松等木本植物，并实现了商业化应用。体胚发生技术应用到椴树方面的研究进展十分缓慢，仅Chalupa[57]提出MS培养基中添加2，4-D 0.5 mg·L-1为欧洲小叶椴体胚最佳诱导条件，成熟的胚性细胞植入添加0.1～0.2mg·L-1IBA的MS培养基中，体胚萌生2～4周长出根和芽。

2 展望

常规无性繁殖(嫁接、扦插)技术研究在近年来得到很大发展，但仍存在很多不足。尤其是目前在椴树属树种的生根机理的解剖学、生理生化(植物激素、酶活性、营养物质等)以及生根过程中养分变化、辅助因子与生根的相互关联性等方面研究较为匮乏，诸多问题有待于进一步研究。

生物技术中的组织培养和体细胞胚培养技术在近年来取得很大进步，主要研究的重点集中在不同外植体的丛生芽诱导、增殖以及生根培养，虽获得了不同椴树的再生植株，但是再生体系并不成熟，有待于进一步完善。同时，对于近些年迅速发展起来的如细胞悬浮培养、突变体筛选等方面并未见报道。随着时代的飞速发展，生物技术的日新月异，体细胞胚胎发生技术将成为林木规模化快繁的重要手段，开辟椴树属植物无性繁殖技术研究新的途径，具有极高的应用价值。相信通过不懈努力，椴树属植物的组织培养工作将会取得更大的成绩，使其综合利用价值更高。