LncRNA BDNF-AS靶向miR-335-5p调控高糖诱导的小鼠足细胞损伤的分子机制

杜燕 李莎莎 徐梦露 刘晓茜 郭晓莉

(西安医学院第一附属医院肾内科，陕西 西安 710077)

足细胞是肾小球脏层上皮细胞，是肾小球滤过的最后一道屏障，足细胞的损伤会导致蛋白滤出，形成蛋白尿，与肾小球疾病密切相关〔1〕。足细胞在糖尿病肾病的发生发展过程中起着重要作用〔2〕。因此，保护足细胞损伤可成为治疗相关肾小球疾病的重要手段。LncRNA广泛参与多种生物学过程，还与肾小球足细胞损伤、肾小管上皮细胞损伤、肾小球系膜细胞的增殖和纤维化、肾小球细胞外基质积聚等病理生理过程相关〔3〕。脑源性神经营养因子(BDNF)是一种多效性神经营养蛋白，有研究发现其对于肾小球发育、形态和功能至关重要，可有效修复足细胞损伤〔4，5〕。BDNF反义因子(BDNF-AS)是一种LncRNA，有研究发现下调LncRNA BDNF-AS的表达可保护高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡〔6〕。沉默LncRNA BDNF-AS通过抑制细胞凋亡和氧化应激可减弱PC12细胞中Aβ25～35诱导的神经毒性〔7〕。研究表明miRNA可通过调控足细胞在肾小球疾病发生发展中发挥重要作用〔8〕。高糖状态下，miR-335-5p促进成骨细胞的增殖，抑制细胞凋亡〔9〕。miR-335通过抑制超氧化物歧化酶(SOD)2表达增加了氧化诱导的视网膜色素上皮细胞损伤〔10〕。然而LncRNA BDNF-AS和miR-335-5p对足细胞损伤的影响及其机制还尚未可知。本实验通过高糖诱导小鼠肾脏足细胞MPC5建立足细胞损伤模型，研究LncRNA BDNF-AS对足细胞损伤的影响及其机制是否与miR-335-5p相关。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠肾脏足细胞系MPC5购自上海名劲生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、RIPA蛋白裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；抗体购自北京博奥森生物科技有限公司；载体质粒购自上海斯信生物科技有限公司；Light Cycler480荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪购自上海仁科生物科技有限公司；流式细胞仪、Power Pac蛋白电泳仪及Gel Doc XR+凝胶显示系统购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 MPC5细胞在37℃、5%CO2，含10%胎牛血清的DMEM完全培养液中培养，每隔2～3 d传代1次，取对数生长期细胞无血清饥饿培养12 h后用终浓度为30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激培养细胞48 h作为高糖(HG)组，同时以终浓度为5 mmol/L的D-葡萄糖溶液处理细胞作为正常对照(NG)组。将si-NC、si-BDNF-AS、miR-NC、miR-335-5p分别转染至MPC5细胞中再用HG处理，记为HG+si-NC组、HG+si-BDNF-AS组、HG+miR-NC组、HG+miR-335-5p组。将pcDNA、pcDNA-BDNF-AS、si-NC、si-BDNF-AS转染至MPC5细胞中，记为pcDNA组、pcDNA-BDNF-AS组、si-NC组和si-BDNF-AS组。将si-BDNF-AS与anti-miR-NC、annti-miR-335-5p分别共同转染至MPC5细胞中再用HG处理，记为HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC组、HG+si-BDNF-AS+antimiR-335-5p组；转染均按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明进行。

1.2.2实时荧光定量(qRT)-PCR检测miR-335-5p和BDNF-AS表达水平 细胞培养48 h后提取总RNA，反转录成cDNA，再按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR扩增，每个样品重复3次，反应条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；72℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-335-5p和BDNF-AS分别以U6和GAPDH为内参，miR-335-5p正向引物：5′-GCGTCAAGAGCAATAACG-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-TGCAGAGGATCTAATT-3′，反向引物：5′-GAAAGACCAGTCCAAGTCC-3′。BDNF-AS正向引物：5′-TACCACAAGGTACCAACCATATATG-3′，反向引物：5′-CATGTGGTTCTGTTTCAATGCCC-3′；GAPDH正向引物：5′-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3′，反向引物：5′-GAGTGATTTTCCCGTCC-3′；引物均由上海生工生物公司合成。

1.2.3Western印迹检测podocin、nephrin、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3蛋白表达 细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品经SDS-PAGE后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，后显影，定影，用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白水平。每个蛋白样品重复3次。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 细胞培养48 h后用不含EDTA的胰酶消化，离心收集后用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，重悬细胞。先后加入Annexin V-FITC和PI各5 μl避光孵育30 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.2.5荧光素酶实验检测BDNF-AS对miR-335-5p的靶向调控 构建野生型和突变型基因靶点BDNF-AS的3′UTR荧光素酶表达载体WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS，用LipofectamineTM2000将miR-NC和miR-335-5p分别转染至MPC5细胞中，再将WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS分别转染至其中，培养48 h后各组细胞中加入荧光素酶试剂盒酶反应底物，充分作用后，测定各组细胞中相对荧光强度。实验重复3次。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1干扰LncRNA BDNF-AS和miR-335-5p对HG诱导的小鼠足细胞中podocin及nephrin蛋白表达的影响 与NG组相比，HG组足细胞LncRNA BDNF-AS表达水平显著升高，miR-335-5p、podocin、nephrin蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)；与HG+si-NC组相比，HG+si-BDNF-AS组LncRNA BDNF-AS表达水平显著降低，podocin、nephrin蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。见表1、图1。

图1 Western印迹检测podocin及nephrin蛋白的表达

2.2干扰LncRNA BDNF-AS表达对HG诱导的小鼠足细胞凋亡的影响 与NG组相比，HG组足细胞凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、酶切caspase3蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)；与HG+si-NC组相比，HG+si-BDNF-AS组细胞凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bax、酶切caspase3蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。见表1、图2，图3。

1～4：NG组、HG组、HG+si-NC组、HG+si-BDNF-AS组图2 Western印迹检测凋亡相关蛋白的表达

图3 干扰LncRNA BDNF-AS表达对HG诱导的小鼠足细胞凋亡的影响

2.3miR-335-5p过表达对HG诱导的小鼠足细胞损伤的影响 与HG+miR-NC组相比，HG+miR-335-5p组miR-335-5p表达水平显著升高，podocin、nephrin蛋白表达水平显著升高，细胞凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bax、酶切caspase3蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。见图4、图5，表2。

图4 Western印迹检测podocin、nephrin和凋亡相关蛋白的表达

图5 miR-335-5p过表达对HG诱导的小鼠足细胞凋亡的影响

2.4LncRNA BDNF-AS靶向调控miR-335-5p的表达 LncBase在线软件预测到BDNF-AS与miR-335-5p存在结合位点。见图6。转染野生型和突变型表达载体WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS后，相较于miR-NC组，miR-335-5p组WT-BDNF-AS鼠足细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。见表3。相较于si-NC组miR-335-5p表达水平(1.01±0.09)，si-BDNF-AS组(2.36±0.23)显著升高(P<0.05)；相较于pcDNA组miR-335-5p表达水平(1.00±0.08))，pcDNA-BDNF-AS组(0.52±0.05)显著降低(均P<0.05)。表明BDNF-AS可靶向调控miR-335-5p。

图6 BDNF-AS的序列中含有与miR-335-5p互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.5抑制miR-335-5p表达逆转了干扰LncRNA BDNF-AS表达对HG诱导的小鼠足细胞损伤的作用 与HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC组相比，HG+si-BDNF-AS+anti-miR-335-5p组miR-335-5p表达水平显著降低，podocin、nephrin蛋白表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、酶切caspase3蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05)。见图7、表4、图8。

1～2：HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC组、HG+si-BDNF-AS+anti-miR-335-5p组；下图同图7 Western印迹检测各组podocin、nephrin和凋亡相关蛋白的表达

图8 抑制miR-335-5p表达逆转了干扰LncRNA BDNF-AS表达对HG诱导的小鼠足细胞损伤的作用

3 讨 论

足突之间裂孔膜蛋白的完整性是肾小球机械过滤屏障的关键，其蛋白表达下降会引起足细胞结构和功能障碍从而导致尿蛋白的产生〔11〕。裂孔膜蛋白podocin、nephrin是维持足细胞裂孔隔膜蛋白形态结构的完整性，使肾小球发挥正常的滤过功能，从而减少蛋白尿漏出的重要分子〔12〕。本研究结果说明HG导致了足细胞损伤，使其产生功能障碍。

抑制LncRNA BDNF-AS可保护视网膜神经节细胞缺血性损伤〔13〕。抑制LncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/复氧受损鼠心肌细胞的细胞死亡和凋亡〔14〕。抑制LncRNA BDNF-AS通过下调miR-130b-5p在急性脊髓损伤中抑制神经细胞凋亡〔15〕。本研究结果说明干扰LncRNA BDNF-AS表达可抑制HG诱导的足细胞凋亡，保护HG诱导的足细胞损伤。

研究报道miR-335-5p靶向抑制血清可溶性klotho蛋白(sKlotho)并促进氧化应激介导的内皮细胞衰老〔16〕。敲低SLCO4A1-AS1通过miR-335-5p抑制膀胱癌的生长和侵袭〔17〕。 本研究结果说明过表达miR-335-5p可抑制HG诱导的足细胞凋亡，保护HG诱导的足细胞损伤，提示LncRNA BDNF-AS可能通过调控miR-335-5p保护HG诱导的足细胞损伤。综上，HG作用的小鼠足细胞中LncRNA BDNF-AS低表达，过表达LncRNA BDNF-AS可抑制细胞凋亡，保护HG诱导的小鼠足细胞损伤，其机制可能与miR-335-5p的表达相关。