基于网络药理学的“槟榔-草果-厚朴”配伍治疗糖尿病肾病作用机制探讨

白晓甜 南 征 宋超群 刘世林

糖尿病肾病（Diabetic kidney disease，DKD）是临床常见的糖尿病并发症。2019 年流行病学调查显示[1]，全球20～70 岁成年人中糖尿病发病率高达9.3%，而DKD 患病人数随糖尿病发病率升高也成比例增长。DKD 以持续性蛋白尿和肾功能进行性下降为主要表现，并且多伴有高血压和眼底病变，最后进展为终末期肾病。研究显示，DKD为发达国家和地区终末期肾病的首要原因。对于此病，现代医学多从降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗氧化应激等方面治疗[2]。中医药在此病的治疗上发挥了其独特优势[3]。尚鑫等[4]应用参芪地黄汤治疗早期糖尿病肾病，患者SCR、BUN、UAER等指标均较治疗前明显改善。王泽等[5]研究发现六味地黄丸可降血糖、血压、血脂，改善肾功能，对于肝肾阴虚型糖尿病肾病疗效确切。吴修红等[6]将当归补血汤加味用于糖尿病肾病的治疗，结果发现其可明显改善患者肾功能，增强患者免疫机能并且减轻机体炎症反应。南征教授将“槟榔-草果-厚朴”三药应用于糖尿病肾病的治疗，经过多年临床实践，收获良效。

本研究通过网络药理学的方法[7]，从槟榔、草果、厚朴三味药的成分及作用靶点出发，分析其治疗糖尿病肾病的作用机制，为导师南征教授运用此三味药治疗本病提供相关佐证，并为糖尿病肾病的治疗提供相关理论参考。

1 资料与方法

1.1 药物成分筛选及其靶点收集和规范应用TCMSP 平 台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharamacology Database and Analysis Platform）对槟榔、草果、厚朴三味中药化学成分进行搜索，并根据ADME 参数进行筛选，保留口服生物利用度（OB）≥30%同时类药性（DL）≥0.18的活性成分。同时通过查阅三味药物治疗糖尿病肾病有关资料补充相关活性成分。最后通过TCMSP 平台收集活性成分作用靶点，并通过UniProt数据库对相关靶点名称进行规范。

1.2 构建药物-成分-靶点网络将药物、成分、靶点相关信息导入Cytoscape 3.7.2 软件，绘制药物-成分-靶点网络图，并根据degree 值提取相关性强的活性成分。

1.3 疾病靶点收集和规范应用GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD 四个数据库，以糖尿病肾病为主题词进行检索，收集、筛选并汇集糖尿病肾病中相关基因，同样用UniProt数据库规范相关靶点名称。

1.4 确定药物与疾病的交集靶点将收集好的药物相关靶点和疾病相关靶点导入网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），绘 制Venny图，获取“槟榔-草果-厚朴”药对与糖尿病肾病的交集靶点。

1.5 蛋白相互作用网络构建将所获取的药物与疾病的交集靶点导入STRING 11.0 平台（https://www.string-db.org/），将物种设定为“Homo sapiens”，设定最小互相作用值（minimum required interaction score）>0.9，其余设置为默认值，获取蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI网络），并将网络导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络处理。

1.6 药物与疾病靶点功能与通路富集分析将槟榔、草果、厚朴三味药物治疗糖尿病肾病的靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），选择物种为Homo sapiens 进行生物学功能及通路的富集分析，并应用相关平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）对数据进行可视化。

1.7 药物活性成分-疾病-靶点-通络网络图的构建应用Cytoscape 3.7.2软件构建槟榔、草果、厚朴成分-糖尿病肾病-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 药物活性成分靶点获取通过TCMSP 平台，初步获得槟榔化学成分52 种，筛选之后获得8 种；初步获得草果化学成分59 种，筛选后获得8 种；初步获得厚朴化学成分139 种，筛选后获得2 种。因筛选具有相关局限性，故通过收集相关文献补充槟榔成分1种，厚朴成分2 种。经过筛选和补充，三药的主要成分包括槲皮素（quercetin）、和厚朴酚（honokiol）、厚朴酚（Magnolol）、(+)-表儿茶素（ent-Epicatechin）、原花青素B1（Procyanidin B1）等，具体成分见表1。通过对成分的再次检索，获得槟榔、草果、厚朴活性成分对应的靶点分别为41 个、174 个和94 个，三药靶点汇集并去重后共获得靶点191个。

表1 槟榔-草果-厚朴三药主要成分表

2.2 药物成分靶点网络图制作根据药物成分及靶点制作相关network 文件和type 文件，并将文件导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制药物-成分-靶点网络图，见图1。通过软件内置Network Analyzer，根据degree 值提取位于前十的活性成分为槲皮素（quercetin）、和厚朴 酚（honokiol）、厚 朴 酚（Magnolol）、桉 叶 油 醇（Eucalyptol）、(+)-表儿茶素（ent-Epicatechin）、(-)-儿茶素[(-)-catechin]、原花青素B1（Procyanidin B1）、邻苯二甲酸二己酯（WLN:6OVR BVO6）、(4E,6E)-1,7-二(4-羟基苯基)-4,6-庚二烯-3-酮[(4E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hepta-4,6-dien-3-one]、新 橙 皮 苷（Neohesperidin）。主要成分degree值见表2。

图1 药物-成分-靶点网络图

表2 关键成分degree值表

2.3 疾病相关靶点获取从GeneCards 数据库中获取糖尿病肾病靶点3459个，设定Score>中位数后获取靶点1751 个，通过DrugBank、OMIM、TTD 三个数据库对糖尿病肾病靶点进行补充，经过汇总去重复值后共获得糖尿病肾病靶点1784个。

2.4 药物与疾病的交集靶点获取将药物靶点和疾病靶点分别导入相关网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），绘制药物疾病靶点交集Venny 图，见图2，并获取药物与疾病的交集靶点，共115个。

图2 槟榔-草果-厚朴与糖尿病肾病交集靶点Venny图

2.5 蛋白相互作用网络构建将所获取的药物与疾病的交集靶点导入STRING 11.0 平台，经过最小互相作用值>0.9 筛选后获得靶点104 个，并构建蛋白相互作用网络（PPI 网络），并将网络导入Cytoscape 软件，利用软件的NetworkAnalyzer功能对网络进行分析，使PPI网络图中的节点根据degree值呈现大小与颜色深浅的变化（节点越大、颜色越深表示degree 值高），见图3。再根据degree值排序获得药物作用于疾病的关键靶点为AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA等。

图3 “槟榔-草果-厚朴”糖尿病肾病靶点PPI网络图

2.6 生物学功能与通路富集分析将槟榔-草果-厚朴与糖尿病肾病交集靶点导入DAVID 数据库进行生物学功能及通路的富集分析，并对结果进行可视化，如图4～图7。

图4～图7 药物治疗疾病靶点功能与通路的富集分析图

2.7 药物成分-疾病-靶点-通络网络图的构建制作成分、疾病、靶点、通路相关network 文件和type 文件，导入Cytoscape软件构建药物成分-疾病-靶点-通络网络图，同样使用Network Analyzer 功能对网络进行分析，使PPI 网络图中的节点根据degree 值呈现大小与颜色深浅的变化（节点越大、颜色越深表示degree值越高），见图8。可知，关键靶点为AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA；关键 通 路为PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、FoxO等信号通路。

图8 成分-疾病-靶点-通路网络图

3 讨论

3.1 “槟榔-草果-厚朴”的作用槟榔为达原饮之君药，草果、厚朴为达原饮之臣药，三药共同构成了达原饮开达膜原、辟秽化浊的基础。槟榔是棕榈科植物槟榔的干燥成熟种子[8]，功能杀虫、行气、利水、消积、截疟。草果为姜科植物草果的干燥成熟果实，有燥湿温中、截疟除痰之功效。厚朴为木兰科植物厚朴的干燥干皮、根皮、枝皮，可行气燥湿消痰、下气除满平喘。三药皆为辛温之药，相辅相成，功效显著。槟榔虽归经于阳明[9]，其疏利之性却能透肠胃、搜膜原；草果虽归于脾经，其烈性却可透脾脏达膜原；厚朴行气散结之力强，可在两药引导之下直击伏于膜原之邪并导之以出。历代医家多应用达原饮治疗疟疾、疫戾之病。现代医家在此基础上，将达原饮应用于更广泛的领域。杨进教授[10]将达原饮的治疗思路运用到多种疾病的治疗上，将槟榔、草果、厚朴三药应用于湿浊郁闭三焦之口腔溃疡、干燥综合征等。吴耀南[11]运用达原饮治疗慢性肝病，认为此病为邪气伏于膜原，故从膜原论治。陈蓓华[12]以槟榔、草果、厚朴为主药治疗小儿病毒性脑炎，总有效率达90.5%。林霜霜[13]还将达原饮加减应用于小儿肠系膜淋巴结炎。在新型冠状病毒肺炎的治疗上，余汉先[14]认为，达原饮能祛胸中膜原之邪，若理化检查符合肺外带、肺下叶毛玻璃影等指征时可以达原饮为底方进行治疗，对患者病情有显著的改善作用。田和炳[15]将槟榔、草果、厚朴作为新型冠状病毒肺炎瘥后防复的宣透方，以达膜原清透余邪，改善瘥后不适症状。

“膜原”一词最早见于《黄帝内经》，其广泛分布在人体，内与脏腑相连，外与体表相通，并与三焦有关。明代吴又可在《温疫论》提出疫戾邪气从口鼻侵犯人体，病位不在脏腑和经络，而为半表半里之膜原，并运用达原饮开达膜原、辟秽化浊以治疗瘟疫之气伏于膜原[16]。南征教授在继承膜原理论的基础上，结合多年临床经验认为，膜原非独疫病可侵入，顽固、秽浊之邪同样可入膜原[17]。消渴肾病是由于消渴日久，脏腑功能失常，毒邪伏于膜原，损伤肾络所致，关键病机为毒损肾络。本病之毒邪深藏膜原，故药难及，邪难出。所以在治疗时运用“达膜原”的方法，用达原饮中三味主药槟榔、草果、厚朴，其中槟榔辛散化浊，厚朴行气散结，草果芳香辟秽。三药合用可直达膜原，使深伏之毒邪溃败，祛毒邪外出，在本病的治疗上发挥了重要作用。

3.2 “槟榔-草果-厚朴”的药理学分析现代药理研究显示，槟榔的成分有生物碱、酚类、氨基酸、维生素等[18]。具体成分包括原花青素A1、原花青素B1等，这类物质具有良好的抗氧化作用，可以应用于氧化应激损伤造成的多种慢性疾病。袁列江等[19]在研究槟榔提取物时发现，不同提取方式提取的槟榔活性成分均能在抗氧化方面发挥相应作用。姚起鑫等[20]研究发现槟榔碱能够调节糖代谢及脂代谢，其降糖原理是减少肝脏糖异生。草果中含有多种活性成分[21]，如酚类、黄酮、挥发油、花青素以及微量元素等，挥发油为其主要成分,草果挥发油[22]的两种成分可协同促进细胞凋亡和抗肿瘤。草果甲醇提取物具有抗氧化活性作用，还可降低甘油三酯和血糖。厚朴的化学成分[23]主要为酚性化合物及挥发油等。厚朴酚、和厚朴酚为主要酚类活性物质，可明显改善机体糖脂代谢，同时抗炎、抗氧化，和厚朴酚还有治疗腹泻、抗抑郁、降血糖的作用。厚朴挥发油（主要为桉叶油醇）及黄酮等成分也有良好的抗炎、抗氧化作用。

以往对槟榔、草果、厚朴单独的药理研究很多，但对于三药共同作用的研究相对缺乏，其对糖尿病肾病治疗方面的药理研究也相对匮乏。本研究通过对槟榔、草果、厚朴三药的活性成分如槲皮素、和厚朴酚、厚朴酚、(+)-表儿茶素、原花青素B1等的分析，找到其治疗糖尿病肾病的相关靶点共115个，主要有AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA 等，经过通路与生物进程分析找到三药发挥作用的生物学通路主要是PI3KAkt、HIF-1、MAPK、FoxO等信号通路。相关具体分析如下。

3.2.1 药物活性成分分析 槲皮素为黄酮类化合物，生物活性及药用价值都很高，具有抗炎、抗氧化的作用，对糖尿病肾病有很好的疗效。靳丽英等[24]通过研究发现槲皮素可通过增强podocin4（足突蛋白）及nephrin（肾病蛋白）的表达，减少糖尿病肾病足细胞损伤，从而降低蛋白尿。宋其蔓等[25]研究发现槲皮素可激活PI3K-Akt 信号通路，从而在糖尿病肾病患者的治疗上起到抗氧化应激、抑制细胞凋亡以及增强细胞活力的作用。和厚朴酚为厚朴中含有的小分子多酚[26]，吴芳等[27]研究发现和厚朴酚具有抗炎、抗菌、抗氧化的作用，对于糖尿病肾病的氧化应激损伤具有切实的治疗作用。厚朴酚对GK大鼠糖尿病肾病模型有一定的保护作用[28]，可降低血糖并降低血浆胰岛素，降低尿蛋白，同时降低内生肌酐清除率。(+)-表儿茶素[29]是一种儿茶素和多酚,具有抗氧化活性。原花青素B1[30]是8种原花青素中活性最强的，可清除有毒自由基，并且有抗炎、降血脂等功用，可抑制炎症反应，减轻细胞损伤，可预防和治疗长期炎症导致的慢性疾病，如糖尿病及其并发症如糖尿病肾病。

3.2.2 关键靶点分析 AKT1 是AKT 激酶的一种。AKT 可介导葡萄糖的摄取和调节[31]。AKT1 调节许多过程，包括细胞存活、增殖、代谢、生长等[32]。MAPK1是MAP 激酶信号转导途径的重要组成部分，可介导多种生物学功能，如细胞生长、黏附、存活和分化[33]。TP53诱导的TRGAR[34]（凋亡调节因子）可维持细胞氧化还原稳态、调节细胞内葡萄糖代谢。IL6参与免疫、组织再生和新陈代谢，可在组织损伤期间进行宿主防御，并可通过GLP-1 介导提高胰岛素敏感性，以适应胰岛素需求的变化[35]。陈丽萍等[36]研究发现，IL6与糖尿病肾病炎性因子相关。IL6 可协调胰岛素需求，但过量会损伤胰岛细胞，且会刺激肾小球膜细胞增生。VEGFA 可诱导血管通透性增加并抑制细胞凋亡[37]。VEGF 升高可促使血管内皮功能损伤，并损伤肾脏基质及其上皮细胞[38]。

3.2.3 主要通路及功能分析 在糖尿病肾病中，PI3K-Akt 信号通路是一条重要的免疫炎症机制通路[39]，可防止细胞凋亡、加快细胞增殖，在疾病进展过程中起重要作用。研究发现，PI3K-Akt信号通路过度激活与本病的发生密切相关[40]。HIF-1信号通路可改善缺氧[41]，但也可对本病起到促进作用。在糖尿病肾病早期，HIF-1 信号通路主要起保护作用，但在糖尿病肾病不断进展的过程中，其诱导的细胞凋亡作用会引起肾脏受损。MAPK 信号通路能对细胞的代谢凋亡产生调控作用，可影响组织细胞糖代谢，从而影响本病进展[42]。FoxO 信号通路对葡萄糖产物的基因转录起到促进作用，但是FoxO 依赖的转录如果增强也会起反向作用，如引发高血糖。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对“槟榔-草果-厚朴”药对治疗糖尿病肾病的相关药理机制进行了初步探究，研究结果初步预测了三味药成分对应的靶点作用于本病的相关机制，为进一步将膜原理论应用于DKD 的治疗提供了先导信息和基础，也为网络药理学研究其它方药的作用机制提供相应借鉴。