血必净通过高迁移率族蛋白1对热应激神经干细胞的保护作用研究

李红波，温敏勇，罗苑苑，郑述铭，张先进，李春河，曹蕊，王林

（广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

热射病是以脑损伤并伴有多器官损害的临床危重症。研究报道，1年中热射病患者的生存率为57%，近30%的存活者出院后仍遗留有神经损伤[1]，严重威胁生命健康。因此，探讨热射病的治疗机制具有重要的研究意义。本课题组前期已成功建立热应激神经干细胞（neural stem cells，NSCs）模型，并证实NSCs损伤机制中涉及氧化应激损伤、细胞凋亡、自噬等分子信号通路的调节[2-3]。我们前期在研究热应激诱导肝损伤的大鼠模型中发现，热应激可促进肝细胞核内高迁移率族蛋白1（HMGB1）向胞浆易位[4]。HMGB1是染色质相关核蛋白和细胞外损伤相关分子模式（DAMP）分子。既往研究表明，细胞内（胞浆）HMGB1不仅可负性调节哺乳动物和酵母细胞的外源性（Fas和其他肿瘤坏死因子受体超家族成员和配体）和内在（线粒体相关和内质网应激相关）凋亡途径，还与自噬的发生密切相关。已有报道血必净注射液治疗热射病可明显降低炎症反应并缩短住院日[5]。血必净注射液（简称“血必净”）是中西医结合急救医学奠基人王今达教授以“三证三法”为辨证原则，以“菌毒并治”理论为指导，以清代王清任血府逐瘀汤组方为基础，研制而成的中药复方静脉制剂，有降低炎症反应、抗氧化应激、调节免疫功能、内皮细胞保护等作用[6-7]。我们前期亦证实，血必净可显著提高热射病大鼠的存活率及减轻下丘脑的氧化应激损伤[8]。为进一步探讨血必净是否通过HMGB1诱导自噬发挥热应激NSCs保护的分子机制，从而为临床救治热射病提供理论基础，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源大鼠脑NSCs，由中国科学院上海细胞生物研究所提供。

1.2 药物、试剂与仪器血必净注射液（生产厂家：天津红日药业有限公司；批准文号：Z20040033）；HMGB1抑制剂——丙酮酸乙酯（Ethyl pyruvate）（江苏康达化工有限公司）。DMEM培养基、胰酶（美国Invitrogen Life Technology公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8）（武汉博士德生物工程有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的免疫球蛋白（IgG）二抗（美国Invitrogen Life Technology公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、Caspase-3活性检测试剂盒（美国Biovision公司）；核蛋白/胞浆蛋白提取试剂盒（美国Thermo Scientific公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（博士德公司）；电化学发光（ECL）检测试剂盒（美国Pierce公司）；抗大鼠p62、微管相关蛋白轻链3（LC3）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、HMGB1、β-actin及Histone单克隆抗体（美国Abcam公司）。DU7400紫外分光光度计（美国Beckman公司）；蛋白质电泳和转膜系统（美国Bio-Rad公司）；Infinite M1000酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.3 分组与细胞模型的建立细胞以1.0×105个/mL密度孵育于培养皿中。实验分为7组，即阴性对照组、热应激组、非热应激+血必净组、热应激+血必净低剂量组、热应激+血必净中剂量组、热应激+血必净高剂量组、热应激+HMGB1抑制剂组。以43℃热应激60 min建立热应激模型[2]，作为热应激组。37℃孵育的细胞作为阴性对照组，阴性对照组细胞始终置于37℃细胞培养箱中培养。

1.4 药物预处理热应激+血必净低、中、高剂量组NSCs在43℃热应激前分别对应用等容积的浓度为5%、15%、25%的血必净预处理30 min；热应激+HMGB1抑制剂组NSCs在43℃热应激前分别用等容积的5 mmol/L丙酮酸乙酯预处理30 min；非热应激+血必净组37℃正常孵育细胞，给予等容积的浓度为25%的血必净预处理30 min；阴性对照组、热应激组给予等容积的生理盐水预处理30 min。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 细胞活力检测按照预设的复温时间点（0、3、6、9 h），在热应激后的不同时间收集细胞培养上清和NSCs，采用CCK-8细胞增殖活性检测试剂盒对各组NSCs活力进行检测。将细胞以1×103个/mL密度接种于96孔细胞培养板中，热应激模型建立后0、3、6、9 h每组加入10 μL CCK-8溶液，孵育1~4 h，应用酶标仪检测450 nm波长处各组细胞的吸光度值。选择热应激复温合适时间，用于后续实验。

1.5.2 Caspase-3活性检测按照Caspase-3活性检测试剂盒的说明书进行操作。取对数期生长的NSCs给予各处理因素后吸取细胞培养液备用，用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中；以600×g4℃离心5 min收集细胞，洗涤，按比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min，离心10~15 min，把上清转移到预冷的离心管中；取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1~3 mg/mL；加入Ac-DEVD-pNA（2 mmol/L）后混匀，37℃孵育60~120 min，发现颜色变化比较明显时，应用紫外分光光度计测定其在405 nm波长处的吸光度值。

1.5.3 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测自噬相关蛋白p62、LC3、mTOR表达将NSCs在43℃热应激前用25%浓度的血必净处理30 min后，用磷酸缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液充分裂解细胞，细胞刮收集细胞碎片并离心；用BCA法检测总蛋白浓度；取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，洗涤；转膜1 h；室温下用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h；分别加入p62、LC3、mTOR等一抗，4℃过夜；洗涤，加入相应的二抗，室温孵育2 h；洗涤后，ECL发光显影，分析X线光片上显影条带的灰度。使用ImageJ软件测得各条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达量。

1.5.4 HMGB1细胞组分检测使用核蛋白/胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞胞核、胞浆蛋白。提取的细胞胞核、胞浆蛋白分别采用Western Blot法检测HMGB1水平，操作步骤同“1.5.3”项。以β-actin作为总蛋白内参，Histone作为核蛋白内参。

1.6 统计方法采用Graphpad prism 7.0统计软件进行数据分析，多组间进行单因素方差分析，两组间采用Fisher最小显著性差异统计检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 热应激复温时间与血必净剂量的选择图1结果显示：与阴性对照组比较，热应激NSCs活力明显下降，并呈时间依赖性，以第9 h复温点细胞活力下降最低（P＜0.01），见图1-A；在相同热应激条件下，随着时间延长，可检测到细胞内凋亡执行蛋白Caspase-3活性明显升高，以热应激复温9 h时间点为最高（P＜0.01），见图1-B。表明热应激复温9 h可明显诱导NSCs活力降低、诱导NSCs发生细胞凋亡。因此，采集热应激复温9 h时间点的NSCs进行后续实验。

图1 热应激对NSCs活力及Caspase-3活性的影响Figure 1 Effects of heat stress on NSCs viability and Caspase-3 activity

而给予低、中、高剂量（对应浓度5%、15%、25%）血必净预处理后，热应激NSCs活力呈剂量依赖性升高，且高浓度25%血必净预处理结果的差异有统计学意义（P＜0.05），见图2-A；Caspase-3活性呈剂量依赖性下降，且高浓度25%血必净预处理结果的差异有统计学意义（P＜0.05），见图2-B。故后续实验均采用高剂量血必净进行预处理热应激NSCs。

图2 血必净对热应激NSCs活力及Caspase-3活性的影响Figure 2 Effects of Xuebijing on viability of heat stressed NSCs and Caspase-3 activity

2.2 血必净预处理可促进热应激NSCs自噬我们进一步观察证实，与阴性对照组比较，热应激组细胞p62、LC3-up水平降低（P＜0.01），p-mTOR、LC3-bottom水平升高（P＜0.01），非热应激+血必净组p62、LC3-up、p-mTOR、LC3-bottom水平均无显著性差异（P＞0.05）；与热应激组比较，血必净处理组p62、LC3-up水平进一步下降（P＜0.01），p-mTOR、LC3-bottom水平明显升高（P＜0.01）；与血必净处理组比较，HMGB1抑制剂处理组p62、LC3-up、p-mTOR、LC3-bottom水平均无显著性差异（P＞0.05）。结果见图3。

图3 血必净预处理促进脑NSCs自噬Figure 3 Xuebijing pretreatment promots autophagy of brain NSCs

2.3 血必净预处理可抑制NSCs凋亡与阴性对照组比较，热应激组细胞Caspase-3表达水平显著升高（P＜0.01），非热应激+血必净组细胞Caspase-3表达水平无显著性差异（P＞0.05）。给予血必净预处理热应激NSCs的结果显示，与热应激组比较，血必净处理组细胞Caspase-3表达水平明显下降（P＜0.01）；与血必净处理组比较，HMGB1抑制剂处理组细胞Caspase-3表达水平无显著性差异（P＞0.05）。具体结果见图4。说明血必净可能是通过HMGB1抑制细胞凋亡。

图4 血必净预处理抑制NSCs凋亡Figure 4 Xuebijing pretreatment inhibits apoptosis of NSCs

2.4 血必净预处理可促进热应激NSCs核内的HMGB1向胞浆转位与阴性对照组比较，热应激处理后NSCs的HMGB1细胞浆表达量增高（P＜0.01），非热应激+血必净组HMGB1的胞浆表达量水平无显著性差异（P＞0.05）；与热应激组比较，血必净处理组HMGB1的胞浆表达量进一步升高（P＜0.01）；与血必净处理组比较，HMGB1抑制剂处理组HMGB1的胞浆表达量水平无显著性差异（P＞0.05）。具体结果见图5。

图5 血必净预处理促进热应激NSCs核内的HMGB1向胞浆易位Figure 5 Xuebijing promotes the cytoplasmic translocation of HMGB1 in the nucleus of heat-stressed NSCs

3 讨论

我们前期研究已证实，热应激可诱导神经干细胞（NSCs）发生严重的细胞凋亡，NSCs自噬是热应激诱导脑组织损伤过程中存在的另一现象。另外，还有研究证实，热应激大鼠模型的大脑皮层神经元及小脑浦肯野细胞自噬相关蛋白在热应激的不同恢复时间的表达显著升高[9-10]。本研究结果显示，热应激可引起NSCs自噬相关蛋白mTOR、自噬标志物LC3水平升高（P＜0.01），表明热应激可诱导NSCs发生自噬。

血必净的主要有效成分包括红花黄色素A、川芎嗪、丹参素、阿魏酸、芍药苷及原儿茶醛等。本研究应用血必净处理后可明显提高热应激NSCs自噬蛋白的表达水平，而凋亡执行蛋白Caspase-3表达水平明显下降，提示血必净可增强自噬并抑制热应激NSCs的凋亡水平。为进一步探讨血必净发挥作用的靶标，本研究聚焦HMGB1与自噬的调控关系。

Kang和Tang等[11-12]研究证实，HMGB1是一种具有自噬活性的Beclin 1结合蛋白。正常状态下，HMGB1位于细胞核内，在炎症、创伤、坏死、氧化、高温和代谢应激期间HMGB1可向胞质和胞外易位。经典的自噬刺激（如雷帕霉素或饥饿）均会导致细胞内HMGB1易位出核。此外，多种原因引起的脑部损伤，如脓毒症脑损伤、脑缺血等，亦可导致HMGB1的出核[13-14]。HMGB1出核后，随即与自噬蛋白Beclin 1相结合，进而促进细胞的自噬[15]。另外，HMGB1对自噬和凋亡的调节依赖于其氧化/还原状态，还原型HMGB1可诱导LC3的形成，抑制Beclin 1/Bcl-2之间的相互作用，促使HMGB1与Beclin 1结合，维持自噬[16]。本研究结果显示，热应激处理后NSCs的HMGB1细胞浆表达量较阴性对照组增高（P＜0.01）；与热应激组比较，血必净处理组HMGB1的胞浆表达量进一步升高（P＜0.01）。为明确血必净是否通过HMGB1增强自噬，我们给予HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯预处理后，检测热应激NSCs p-mTOR、LC-bottom等自噬蛋白及Caspase-3表达水平，发现与血必净处理组无显著性差异（P＞0.05），结果表明血必净可能是通过HMGB1而发挥作用。

为进一步明确热应激后HMGB1的细胞内亚定位，我们检测了热应激神经元细胞核浆中HMGB1的表达量，发现血必净处理后，HMGB1在热应激NSCs中的出核定位显著升高，丙酮酸乙酯处理后HMGB1的胞浆转位及自噬水平明显下降，表明血必净通过促进HMGB1出核增强自噬减轻凋亡。

综上所述，血必净可以通过促进HMGB1出核增强自噬，减少凋亡，从而发挥脑保护的作用，提示血必净作为HMGB1的增强剂，在热射病脑损伤的治疗中具有广阔的应用前景，可为深入研究血必净的药效物质基础提供新的思路，其进一步的分子机制仍需展开基础及临床研究深入探讨。