两个产地洋葱的UHPLC图谱分析及前列腺素A1含量测定

王晓婷 谭 超 王燕华 秦太峰 张乃明, 李芳艳

(1. 云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2. 云南省土壤培肥与污染修复工程实验室，云南 昆明 650201；3. 云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201)

洋葱(AlliumcepaL.)又称为球葱、圆葱、玉葱、葱头，为石蒜科葱属植物。在中国南北均有种植，由于产地、品种、气候环境、土壤等因素的影响，洋葱品质各异。洋葱中含有丙基二硫等硫化物[1]、芹菜素等黄酮类化合物[2-3]、蒜氨酶等酶类[4]、螺甾烷醇型和呋甾烷醇型的甾体皂苷化合物[5]、含氮化合物[6]以及葡萄糖[7]等多种活性成分。除此以外，洋葱还是极少数富含前列腺素(Prostaglandin, PG)的蔬菜之一[8]。洋葱中的PG主要包括PGA1、PGA2、PGB1、PGE1和PGF1α等[9]，具有抗炎、抗氧化、杀菌、降血压、降血糖及预防心脑血管疾病等作用[10-11]。目前对洋葱活性成分的研究主要集中在黄酮、多糖、含硫化合物等[12-14]，PGA1更多被应用于临床治疗[15]，而云南与黑龙江洋葱化学成分含量的区别及PGA1含量尚不明确。

超高效液相色谱(Ultra-High Pressure Liquid Chromatography, UHPLC)相比HPLC具有更高效率、超快速、高灵敏、应用范围广及有机溶剂用量少等优点，被广泛用于中药材质量控制[16]。试验拟采用UHPLC测定两个产地洋葱的化学成分含量与PGA1含量，以期为洋葱后续开发利用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 样品

共采集两个产地(云南省红河州和黑龙江省齐齐哈尔市)23批洋葱样品，均采集自2020年(表1)。

表1 洋葱品种与产地†

1.1.2 主要试剂

PGA1标准品(CAS：14152-28-4)：纯度98%，北京元宝山色谱科技有限公司；

甲醇(CAS：67-56-1)、七氟丁酸(CAS：375-22-4)：色谱纯，美国Fisher公司；

超纯水:南京欧铠环境科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱系统：Thermo Scientific UltiMate 3000型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

色谱柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，3.0 μm)型，北京迪马欧泰科技发展中心；

高速粉碎机：JP-500C型，浙江久品工贸有限公司；

分析天平：ME204T/02型，梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司；

恒温水浴锅：HH-4型，上海力辰邦西仪器科技有限公司；

电热鼓风干燥箱：101-2B型，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的处理 新鲜洋葱切碎于50 ℃鼓风干燥12 h，粉碎后过100目筛。取洋葱粉0.5 g置于具塞锥形瓶中，加5 mL甲醇，超声(功率120 W、频率40 kHz)提取30 min，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm滤器过滤，即为洋葱PGA1供试品溶液。

1.3.2 PGA1对照溶液的制备 准确称取PGA1标准品1.00 mg，用甲醇稀释并定容至10 mL，制成0.1 mg/mL的标准溶液。

1.3.3 PGA1含量测定 参照孙启良等[17]的方法，修改如下：

色谱柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，3.0 μm)，流动相：A为0.1%七氟丁酸水溶液，B为甲醇；流速0.6 mL/min，梯度洗脱(0～5 min，5% B；5～35 min，5%～95% B；35～40 min，95% B；40～42 min，95%～5% B；42～47 min，5% B)。柱温35 ℃，平衡时间0.5 min，进样体积5.0 μL；UV检测器检测波长254 nm。

1.3.4 方法学考察

(1) 精密度试验：取制备的洋葱(W)样品溶液，供试品溶液适量，重复进样6次。以PGA1为参照峰，计算PGA1峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差。

(2) 稳定性试验：取制备的洋葱(W)样品溶液，供试品溶液适量，在室温条件下(20～25 ℃)放置0，2，4，8，12，24 h，进样。以PGA1为参照峰，计算PGA1峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差。

(3) 重复性试验：取制备的洋葱(W)样品溶液，制备6份供试溶液后进样。以PGA1为参照峰，计算PGA1峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差。

1.4 数据处理

利用TBtools 1.05进行匹配矩阵绘制，SPSS 24.0进行Pearson相关性及聚类分析对比不同产地不同洋葱样品之间化学成分的共性和差异性，SIMCA14.0进行PCA及OPLS-DA分析，Origin 2019b进行PGA1含量分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验 PGA1峰的相对保留时间RSD为1.01%，相对峰面积RSD为2.13%，表明仪器精密度良好。

2.1.2 稳定性试验 PGA1峰相对保留时间RSD为0.34%，相对峰面积RSD为2.71%，表明供试品溶液在室温条件下保持稳定。

2.1.3 重复性试验 PGA1峰相对保留时间RSD为1.21%，相对峰面积RSD为3.25%，表明该方法重复性良好。

2.2 基于UHPLC洋葱化学成分含量图谱

取23批洋葱样品进行UHPLC测定，得到洋葱样品叠加图谱并对共有峰标示(图1)。23批洋葱样品共有73个共有色谱峰，出峰时间为1～48 min。对比不同批次洋葱同一保留时间色谱峰，部分色谱峰具有差异，说明不同产地洋葱间化学成分含量具有差异。

13. 前列腺素A1

2.3 化学成分分析

对UHPLC图谱每个峰进行积分峰面积分析(图2)，T、C、J、D等样品检出化学成分积分总峰面积较大。共有色谱峰中12，18，35，51，60号峰面积较大较明显分辨，说明这些峰所对应的化学成分相对含量较高。通过对比发现云南洋葱的这些峰平均峰面积均比黑龙江洋葱高，12，18，35，51，60号均分别高出23.84%，13.32%，21.12%，40.77%，51.51%。且云南洋葱检出的平均总峰面积为12 916 919，黑龙江洋葱检出的平均总峰面积为10 546 150，云南洋葱比黑龙江洋葱平均总峰面积高出22.48%，表明云南洋葱所含化学成分含量比黑龙江洋葱更高。

图2 洋葱UHPLC指纹图谱检出化学成分总峰面积图

2.4 Pearson相关性及聚类分析

对23批洋葱样品共有的73个化学成分变量进行SPSS Pearson相关性及聚类分析(图3)。云南洋葱样品G、A、B、H之间化学成分含量具有相关性，相关性大于0.94；黑龙江洋葱样品N、Q、R、U、O、T化学成分含量具有独立性，与其他洋葱样品之间相关性较低，相关性为0.39～1.00；云南洋葱样品I、K、E、F、C、J、D与黑龙江洋葱样品V、S、M、P、L、W之间化学成分含量具有相关性，相关性大于0.82，其中云南洋葱样品E、F、C、J、D相关性大于0.94。

从图3可以看出，不同产地、不同批次的洋葱样品化学成分含量相关性差异不明显，Pearson相关性及聚类分析不能直观区分两个产地洋葱化学成分含量直接差异性。

图3 洋葱样品Pearson相关性及聚类分析图

2.5 主成分分析(PCA)

PCA分析通过线性变换降维处理，以较少的指标反映尽可能多的信息，并对具有代表性的主成分进行可视化[18]。所建模型累积解释能力参数R2X=0.673>0.5，预测能力参数Q2=0.356<0.4，说明模型的拟合准确性差，不能够较好充分反映数据信息，理论上R2和Q2数值大于0.4可接受，大于0.5较好，越接近1说明模型越好[19-20]。对23批样品进行PCA分析，从PCA得分图(图4)可以直观看出，每个点分布距离越远表明差异性越大，黑龙江洋葱中Q、P、O、T与其他样品化学成分含量差异较大，与匹配矩阵分析结果相似。其他样品中，两个产地洋葱样品出现混杂情况，无法区分不同产地洋葱化学成分含量差异性。表明用PCA构建模型未能将两个产地的洋葱化学成分含量进行有效区分。

图4 洋葱样品PCA分析图

2.6 正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)

为更好区分两个产地间洋葱，对获取的UHPLC数据进行OPLS-DA多元统计分析。通过SIMCA14.1软件建模OPLS-DA分析23批洋葱中共有的73个化学成分变量，得到OPLS-DA散点图(图5)、VIP值图(图6)和S-plot图(图7)。OPLS-DA分析相比聚类分析、匹配矩阵和PCA分析能更有效区分两个产地洋葱中化学成分含量存在差异。图5表明两个产地洋葱能够较好区分，A、B、G样品聚集，说明化学成分含量差异较小，K、M、L样品聚集，说明化学成分含量差异较小，Q样品较为特殊虽产自黑龙江但化学成分含量接近云南产洋葱。VIP值可衡量各共有特征峰的表达模式对样本分类判别的影响强度和解释能力，从而辅助筛选质量差异标志物[21]。VIP>1表明该变量对所建模型的贡献度高于平均水平[22]。VIP值越大对地域判别的差异性越显著[23]。以VIP>1为筛选标准，筛选云南与黑龙江两个产地洋葱间化学成分含量差异的主要标志性物质。创建模型后自动拟合获得累积解释能力参数R2X=0.537>0.5，累积解释能力参数R2Y=0.775>0.5，说明53.7%的变量可解释77.5% 的组间差异。预测能力参数Q2=0.625>0.5，表示该模型稳定可靠，且能够较好充分反映数据信息，具有较好的预测能力，能够对两个产地之间的化学成分含量进行正确分类，后续可用于化学成分含量之间的区分。

图5 洋葱样品OPLS-DA分析图

OPLS-DA模型置换检验permutation test，以确定模型是否过拟合。云南(图6)与黑龙江(图7)洋葱的permutation test结果表明，两组样本结果在y轴上的截距小于0，模型没有过拟合，具有较好的预测能力。

图6 黑龙江洋葱的OPLS-DA 置换检验图

图7 云南洋葱的OPLS-DA置换检验图

提取OPLS-DA模型中变量重要性投影(VIP)图，见图8，以VIP值>1.0为标准筛选化学成分差异标志物，在云南与黑龙江两个产地洋葱间共得到11个VIP值>1的共有峰，分别为60号峰(VIP值为4.75)、51号峰(VIP值为3.50)、35号峰(VIP值为1.90)、2号峰(VIP值为1.80)、71号峰(VIP值为1.60)、15号峰(VIP值为1.50)、53号峰(VIP值为1.40)、32号峰(VIP值为1.30)、66号峰(VIP值为1.20)、18号峰(VIP值为1.25)、12号峰(VIP值为1.10)。说明这些峰所代表的化学成分是造成云南与黑龙江产地洋葱间化学成分含量差异的主要标志性物质[24]，但这些成分还有待于进一步鉴别。S-plot图(图9)，差异性化合物分布在S型曲线的上下端，右上端VIP值大于1的差异化合物色谱峰60，51，35，15，53，32，66，18，12，表示云南洋葱中峰面积较大的化合物，云南洋葱中这些化合物含量显著高于黑龙江洋葱。左下端VIP值大于1的差异化合物色谱峰2，71，表示云南洋葱中峰面积较小的化合物，表示云南洋葱中这些化合物含量显著低于黑龙江洋葱。

图8 洋葱样品OPLS-DA VIP值图

图9 洋葱样品OPLS-DA S-plot图

2.7 不同产地洋葱中PGA1的含量分析

PGA1是洋葱中特征活性成分，云南的10批洋葱样品PGA1平均含量为(197.21±63.22) mg/kg，黑龙江的13批洋葱样品PGA1平均含量为(121.37±43.12) mg/kg(图10)。洋葱中营养活性成分的累积受品种、种植环境、光照、生长温度、土壤、施肥等因素的影响。从日照角度来看，洋葱属于长日照作物，在中国北方多种植长日照晚熟种，日照刚好拥有适宜于鳞茎膨大和抽薹开花所需的14 h以上长日照条件。而中国南方多种植短日照早熟品种，在高温短日照条件利于长叶不利于形成葱头。从PGA1含量来看云南洋葱中PGA1含量比黑龙江的洋葱更高，可能短日照更能促进PGA1累积。从温度对营养活性成分的累积来看，洋葱适宜的生长温度为13～26 ℃，种子和鳞茎可在3～5 ℃下发芽[25]。云南省红河州建水县年平均气温19 ℃[26]。黑龙江齐齐哈尔年平均气温3.9 ℃[27]。南方更适宜于洋葱生长和PGA1累积，当然PGA1的累积可能受多种因素影响，还可能与土壤、施肥[28]等因素相关，张郑等[29]研究表明环境条件及土壤理化性质不同，洋葱品质差异较大。因此影响洋葱中营养活性成分含量的具体因素有待于进一步研究。

图10 不同产地洋葱中PGA1含量测定结果

3 结论

洋葱超高效液相色谱化学成分含量图谱共标定73个共有色谱峰，通过OPLS-DA分析有效区分出云南和黑龙江两个产地洋葱的化学成分含量，结合VIP值>1、P<0.05 和S-plot分析共筛选出11种主要差异标志物。云南洋葱前列腺素A1平均含量[(197.21±63.22) mg/kg]显著高于黑龙江洋葱[(121.37±43.12) mg/kg]，可能与种植环境等诸多因素有关。但试验仅对不同产地中洋葱化学成分含量与前列腺素A1含量的差异进行探索，今后可以通过扩大采样范围及采集品种的方法，调查生长环境和栽培技术，获取更多的样本信息进行分析，可为洋葱后续的深入开发利用提供更多依据。