MOB1蛋白通过调控AKT/Cyclin D1信号通路促进肝癌细胞增殖

陈建林，陶江涛，帅建，艾小江，郑锦锋，余小舫，肖凌云，凌云志，曾小斌

（深圳市人民医院龙华分院，广东 深圳 518109，1.普外科，3.中心实验室；深圳市人民医院，广东 深圳518020，2.肝胆外科，4.感染病科）

肝癌是我国第4 位常见恶性肿瘤及第2 位肿瘤致死病因。研究显示，2018 年全球共有841 080 例新发肝癌病例[1]，其中肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最主要的原发性肝癌种类，占比85%～90%[2]。肝癌具有起病隐匿、进展快、复发早、预后差等临床特点，在过去几十年的发展中，尽管有部分针对肝癌的治疗方法及药物出现，但是肝癌的耐药强、进展快及复发率高等问题并未解决，患者5年生存率仅约32.5%，严重威胁人类健康[3]。究其原因，人们对肝癌发生发展的分子机制并不十分清楚。因此，寻找肝癌相关基因，对于理解发病机制及寻找早期诊断和治疗的分子标志物均具有重要意义。

Hippo信号通路是近年来发现的与肝癌发生发展密切相关的重要通路。Hippo信号通路在进化中高度保守，当细胞处于高密度生长或营养缺乏的环境中时，Hippo信号通路即被激活，MST激酶（mammalian sterile 20-like kinase）被磷酸化，在MOB1（Mps One Binder kinase activator protein 1，Mps一结合者激酶激活因子样1）蛋白的辅助下，磷酸化下游的LATS蛋白（large tumor suppressor kinases）；随后，激活的LATS蛋白磷酸化转录共激活因子YAP蛋白（Yes-associated protein）和TAZ蛋白（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif），限制其入核，降低Hippo通路下游靶基因的转录，包括CTGF、CYR61、ITGAV等多个被报道与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移密切相关的基因[4]。经典的Hippo-YAP/TAZ信号通路被证明是促进肝癌发生发展的关键调控通路[5]，YAP蛋白高表达是肝癌发生的早期事件，对于肿瘤的形成至关重要[6]。YAP蛋白的表达水平与肝癌的Edmondson-Steiner分级、血清甲胎蛋白水平及预后显著相关，是肝癌重要的独立预后指标[7]。YAP和TAZ蛋白能促进肝癌的侵袭和转移[8]。此外，Hippo-YAP/TAZ通路还能影响肝癌的耐药性，如过表达YAP蛋白能促进肝癌的索拉非尼耐药[9]。相反，MST和LATS蛋白在肝癌中主要扮演抑癌的角色，如MST1/2 缺失能够大幅降低YAP蛋白的S127 位磷酸化，促进其入核，并促进肝癌细胞的生长[10-11]。

在Hippo信号通路中，MOB1蛋白的功能研究相对较少，已报道的大部分研究指出MOB1 在肿瘤发生发展中扮演抑癌的角色，但其作用尚存在争议[12]。人MOB1 蛋白包括两个序列高度相似的同源蛋白MOB1a和MOB1b，两者之间有96%的相同序列。在结直肠癌中，MOB1 在肿瘤组织中显著低表达，与淋巴转移及预后不良相关，且过表达MOB1 能够显著抑制结直肠癌细胞系的增殖、迁移能力[13]。泛素连接酶Praja2通过促进MOB1蛋白的降解，促进胶质母细胞瘤的生长[14]。MOB1a/1b基因双敲除会造成胚胎致死性，但MOB1aΔ/+1btr/tr和MOB1aΔ/Δ1btr/+小鼠相比于对照小鼠MOB1aΔ/+1btr/+更易形成包括肝癌在内的各种自发性肿瘤[15]。然而也有研究指出，MOB1蛋白能促进肿瘤的侵袭和复发，且可能在不同的肿瘤类型中发挥不同的功能。在支气管肺泡上皮细胞条件性MOB1a/b双敲除的小鼠中，其肺部并未形成自发肺腺癌，且尿烷诱导的肺肿瘤发生率下降[16]。MOB1 在51.2%的非小细胞肺癌组织中高表达，且MOB1 高表达与患者生存期缩短密切相关；进一步研究发现，MOB1 蛋白能够促进肺癌细胞的侵袭能力[17]。在肝癌中，MOB1蛋白对于肿瘤的生成、增殖、侵袭及迁移的影响并未得到系统性研究。本研究将利用生物信息学探索MOB1基因在肝癌组织中的表达情况，并分析MOB1 高表达与患者生存期之间的关系；收集肝癌临床组织样本，利用Western blotting验证MOB1蛋白的表达水平；在MOB1敲低及过表达肝癌细胞系中，研究MOB1 蛋白对细胞增殖及细胞周期的影响，并用Western blotting检测相关信号通路蛋白的变化，探索MOB1蛋白在肝癌中的作用。

1 材料和方法

1.1 TCGA数据库分析

从TCGA数据库中获取肝癌表达谱及生存数据，包括50例正常样本及371例肿瘤样本。统计正常样本与肿瘤样本中MOB1a和MOB1b的表达量并分析其表达。使用UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu）在线分析MOB1与生存预后的关系。

1.2 样本收集

本研究获得深圳市人民医院医学伦理委员会的审查和批准（LL-KY-2019422），且已取得所有受试者本人签署的知情同意书。28例肝癌组织及癌旁组织来自深圳市人民医院手术切除标本（收集时间自2020年1月至2020年12月），其中包括15例肝细胞性肝癌（HCC）、5 例肝内胆管癌、3 例肝血管癌、1 例肝细胞腺癌、2例纤维性肝癌、1例直肠癌肝转移、1例乳腺癌肝转移，所有样本均有明确的病理诊断报告。将每例患者的癌旁组织与癌组织进行配对研究，样本取得后，立即切成小块分装，并储存于液氮中，直至使用。取50 mg左右的组织，加入含蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂的强效RIPA缓冲液，在冰上进行高速研磨裂解后，12 000 g离心15 min，取上清进行蛋白定量，并加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸15 min后于-80 ℃储存。

1.3 细胞培养及细胞活力测定

人肝癌细胞系Huh7和HepG2培养于含10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基中，置于含5% CO2的37 ℃细胞培养箱中进行培养。在细胞增殖实验中，将Huh7和HepG2细胞分别以2.5×103、5×103个/孔的密度接种于96孔板中进行培养，于24、48、72、96 h加入10%的CCK-8溶液，继续培养2～3 h，测定450 nm处吸光值并计算细胞活力。

1.4 siRNA敲低

MOB1a和MOB1b的siRNA及阴性对照NCsiRNA由上海吉玛生物科技公司设计及体外合成。序列如下表1所示。转染前1 d取对数生长期肝癌细胞传代于6 孔板或96 孔板中继续培养12 h，用GP-transfect-Mate试剂按照说明书进行转染。

表1 双链siRNA序列

1.5 MOB1a过表达细胞系构建

利用慢病毒介导的过表达质粒pLVX-3Flag-puro构建稳定过表达的细胞系。将全长的人MOB1a的编码序列克隆至pLVX-3Flag-puro质粒中，测序确定序列正确性。将psPAX2和pMD2.G及目的质粒共转染至293T细胞中进行病毒包装，于48 h和72 h收集含病毒液上清，并用0.45 μm的滤膜过滤。将病毒液加入至目的细胞中，转染48 h后用puromycin进行筛选，建立稳定转染细胞系。用pLVX-3Flag-puro载体转染的细胞作为对照。利用Western blotting鉴定Flag-MOB1a的过表达效果。

1.6 细胞周期检测

用0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞后，离心收集细胞，用PBS清洗1 次，随后用预冷的70%乙醇溶液过夜固定细胞，最后加入100 mg/L RNaseA和50 mg/L PI溶液，置于37 ℃孵育30min，用40 μm滤膜过滤后用流式细胞仪检测细胞周期的变化情况。

1.7 蛋白表达量检测

采用Western blotting法。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，随后通过湿法电泳转移方法将蛋白转移至0.45 μm的PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗溶液在室温孵育1 h或在4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜3次。再加入HRP标记的二抗，继续在室温孵育1 h，用TBST洗膜3次，然后用ECL化学发光试剂盒进行显影。

1.8 统计学分析

应用SPSS 13.0 统计软件进行实验数据的统计分析，数据以（）表示，多组均数之间采用单因素方差分析进行比较，进一步两两比较采用SNK（Student-Newman-Keuls）-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库中MOB1在肝癌中高表达

对TCGA数据库样本进行研究发现，MOB1a和MOB1b两个基因在肝癌组织中mRNA表达水平均呈显著上调（图1A和1C）。随后进行预后生存分析，将样本分为MOB1高表达组和MOB1低表达组，结果显示MOB1a和MOB1b两个基因高表达组的生存率均显著下降（图1B和1D）。以上结果提示，MOB1高表达促进了肝癌的发生发展，且表达量越高，预后越差。

图1 TCGA数据库分析MOB1 mRNA表达水平及其与肝癌的关系

2.2 在临床组织样本中验证MOB1在肝癌中高表达

提取肝癌组织及配对癌旁组织的总蛋白，利用Western blotting检测MOB1蛋白表达水平。本研究中，临床组织样本涉及的28例患者基本信息见表2和表3。MOB1在13例HCC样本（13/15，86.7%）和7例其他类型肝癌样本（7/13，53.8%）中高表达，结果如表4所示。此外，与其他类型肝癌相比，MOB1蛋白相对表达量在HCC的组织样本中显著升高（P＜0.05），见图2。

图2 临床组织样本中MOB1蛋白的表达水平

表2 临床样本库中15例HCC患者的基本信息（例）

表3 临床样本库中13例其他类型肝癌患者的基本信息（例）

表4 MOB1在肿瘤样本中的表达情况统计

2.3 MOB1 蛋白过表达促进肝癌细胞增殖并增加G2/M期细胞比例

MOB1a与MOB1b蛋白具有高度同源性，MOB1a基因在肝癌细胞中表达量大于MOB1b基因。因此，后续实验选择MOB1a基因作为MOB1 的代表进行研究。Western blotting结果表明，在Huh7 和HepG2 细胞中，稳定过表达细胞系Flag-MOB1a构建成功（图3A和3D）。相比于空载对照组（pLVX），Flag-MOB1a组的细胞增殖能力（图3B和3E）与G2/M期的细胞比例（图3C和3F）均明显上升（P＜0.05）。上述结果表明，MOB1 的表达与肝癌细胞的增殖呈正相关。

图3 MOB1蛋白过表达对Huh7和HepG2细胞增殖和细胞周期的影响

2.4 MOB1蛋白低表达抑制细胞增殖及降低G2/M期细胞比例

为了进一步探究MOB1蛋白与肝癌细胞增殖的关系，本研究先采用siRNA下调Huh7和HepG2细胞中MOB1 的表达，然后采用CCK-8 方法检测MOB1的低表达对Huh7和HepG2细胞增殖的影响。Western blotting检测结果显示：与对照组相比，转染MOB1 siRNA的细胞MOB1 的蛋白表达明显受到抑制（图4A和4D，P＜0.05），表明MOB1 的干扰效率显著。同时，Huh7 和HepG2 细胞的增殖速度亦显著被抑制（图4B和4E，P＜0.05）。细胞周期检测发现，与NC-siRNA肝癌细胞相比，MOB1低表达能显著降低G2/M期细胞比例（图4C和4F）。

2.5 MOB1 蛋白低表达能显著降低Cyclin D1 及p-AKT表达水平

MOB1 是一种重要的细胞周期调节因子，然而MOB1蛋白低表达导致肝癌细胞增殖速度降低是否通过影响细胞周期还有待探究。如图4 所示：与对照组相比较，G2/M期肝癌细胞比例随MOB1蛋白表达下调显著下降，提示MOB1低表达可能导致Huh7和HepG2细胞周期阻滞，进入M期进行有丝分裂的肝癌细胞数量减少（图4D，4H）。通过蛋白检测发现，MOB1低表达可导致Cyclin D1表达下降；反之，MOB1过表达使Cyclin D1表达升高（图5）。众所周知，细胞周期调节蛋白是细胞周期进程的重要调控因子，因此上述结果表明MOB1 低表达可通过调节关键的细胞周期调节因子导致肝癌细胞周期停滞。

图4 MOB1蛋白敲低表达对Huh7和HepG2细胞增殖和细胞周期的影响

在经典的Hippo-YAP信号通路中，MOB1 蛋白主要作为接头蛋白介导MST1/2激酶和LATS1/2激酶之间信号转导，这一系列事件最终导致YAP的S127磷酸化，抑制其入核[18]。然而本研究发现，在Huh7和HepG2细胞中，MOB1过表达或敲低表达时，YAP的S127磷酸化水平均无明显变化。在检测其他与细胞周期相关的信号通路蛋白时发现，AKT的Ser473磷酸化水平与MOB1表达水平呈正相关（图5）。因此，在肝癌细胞中，蛋白MOB1 可能不是通过Hippo-YAP信号通路而是通过AKT信号通路来调节细胞周期的。

图5 MOB1蛋白过表达及敲低表达对Huh7细胞及HepG2细胞相关信号通路的影响

3 讨论

MOB1 作为细胞周期调节因子，在多种肿瘤中呈低表达，扮演着抑癌的角色，但其作用尚存在争议[19]。关于MOB1 是否参与肝癌细胞的生物学作用，国内外尚缺乏相关报道。本研究首先通过检索TCGA数据库，经分析发现MOB1a和MOB1b的mRNA表达水平在肝癌组织中均显著上升，且MOB1的高表达与患者的生存率下降显著相关。同时，在肝癌临床组织样本中，MOB1蛋白显著高表达。本研究通过在Huh7和HepG2细胞内过表达MOB1蛋白，发现细胞的增殖速率变快，且处于分裂期的细胞比例显著升高；反之，MOB1蛋白敲低后，处于分裂期的细胞比例显著降低。这些结果说明，MOB1蛋白可能通过调控细胞周期扮演着促进肝癌发生发展的角色。

Cyclin D1是一种重要的细胞周期调控因子，在癌症的发病机制中发挥核心作用。在正常细胞中，Cyclin D1的表达水平受到严格的调控；相反，在癌症中其活性以各种方式增强[20]。本研究发现，MOB1低表达能下调Cyclin D1的表达。因此，MOB1蛋白可能通过调控Cyclin D1蛋白表达影响肝癌的细胞周期及细胞增殖。

现有的研究主要报道MOB1蛋白是一种细胞内的辅调节蛋白，即MOB1 直接与蛋白激酶结合，然后影响其与上下游其他蛋白的相互作用，如在Hippo-YAP信号通路中介导MST1/2 及LATS1/2 蛋白之间的信号转导[19]。在鼠和果蝇中，MOB1 蛋白缺失会造成胚胎致死或严重畸形；然而，在人HEK293A细胞中，MOB1 蛋白敲除细胞依然能够存活，但Hippo通路的信号转导受到了影响，如在血清饥饿的处理下YAP蛋白的磷酸化显著下降，这说明MOB1在HEK293A细胞中能促进YAP蛋白的磷酸化，调控经典的Hippo-YAP通路[21]。在Huh7和HepG2细胞中，MOB1蛋白过表达及敲低后，YAP的S127位磷酸化水平无明显变化；但是，MOB1 蛋白的过表达能够激活AKT蛋白磷酸化。YAP蛋白是Hippo信号通路的效应因子，YAP蛋白的磷酸化是其入核调控下游基因转录的开关机制[22]。在肝癌中，激活的AKT蛋白被证明能控制肝癌细胞的增殖和凋亡，影响肝癌的分化及转移，如利用LY294002处理抑制AKT蛋白S473位点磷酸化，能诱导细胞周期阻滞，显著增加G0/G1期细胞比例，降低增殖及周期相关蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin D3、Cyclin E、Cyclin A的表达水平[23]。因此，本研究认为，MOB1 可能通过调控AKT/Cyclin D1 信号通路影响肝癌细胞周期和细胞增殖。

综上所述，MOB1 蛋白在肝癌中并不是传统意义上的抑癌基因，相反在肝癌组织中显著高表达。因此，MOB1可能作为一个促癌基因，调节细胞周期，参与肝癌的进展，具有重要的临床意义。