异常凝血酶原对肝癌合并门静脉癌栓的预测价值

童敬澍，马浙平，毛书奇，卢长江，陆才德

（宁波大学附属李惠利医院 肝胆胰外科，浙江 宁波 315040）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上第五大常见的恶性肿瘤，全球每年新增HCC近70 万人，其中50%发生在我国，其病死率在我国恶性肿瘤中位列第二[1]。门静脉癌栓（portal vein tumor thrombosis，PVTT）作为HCC最常见的并发症之一，是引起HCC患者肝功能减退、门静脉高压、肿瘤转移复发的重要原因，伴有PVTT的HCC患者自然病程仅为3个月，预后较差[2]。异常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-II，PIVKA-II）是在肝癌细胞中，因凝血酶原前体羧化不足产生的蛋白质。研究发现PIVKA-II在HCC的增殖、血管浸润和转移过程中发挥作用，并与微血管侵犯（MVI）独立相关[3]。然而PIVKA-II与PVTT大血管的关系尚不明确，本研究旨在探究PIVKA-II与PVTT的关系，及其在HCC患者发生PVTT的预测价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

回顾性收集自2019年9月至2020年12月宁波大学附属李惠利医院肝胆胰外科收治的206例HCC患者临床资料，按照纳入排除标准，最终有191例患者纳入本研究，如图1。纳入标准：（1）依据《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》[4]确诊为HCC；（2）于我院行一次及以上腹部增强CT或MRI平扫，并且行一次及以上血清PIVKA-II、D-二聚体、AFP、AFP-L3、血常规、生化全套检测。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）行HCC根治术后肿瘤复发；（3）伴其他全身严重疾病；（4）长期服用华法林、维生素K及其拮抗剂。本研究通过医院伦理委员会审批（审批号：KY2020PJ125）。

1.2 PVTT诊断和分型评估

本组HCC患者的PVTT通过腹部增强CT或MRI诊断，所有影像资料均由两位及以上具有副高以上年资的影像科医师判读。PVTT的分型按照程氏分型标准：I型，癌栓侵及肝叶或肝段的门静脉分支；II型，癌栓侵及门静脉左或右支；III型，癌栓侵及门静脉主干；IV型，癌栓侵犯及肠系膜上静脉[5]。

1.3 分组和内部验证方法

为研究PIVKA-II对HCC患者发生PVTT的预测价值并确定其最佳截断值，本研究采用队列内部验证方法，即所有HCC患者按照3∶2的比例随机分为试验组和验证组，在试验组中计算PIVKA-II和D-二聚体的最佳截断值，并在验证组中验证其预测PVTT的价值，见图1。

图1 分组方法及设计思路示意图

1.4 检验仪器与标本处理

使用μTASWako i30全自动电泳荧光免疫分析仪（日本）及配套检测试剂盒（富士胶片和光纯药株式会社）检测所有HCC患者的血清PIVKA-II、甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白异质体（AFP-L3）；其余相关血液指标包括白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素（TBIL）、凝血酶原时间（PT）、凝血功能国际标准化比值（INR）。所需的血液标本均在HCC患者进行手术、介入或化疗前空腹时采集，并经过3 500 r/min离心10 min分离血清，且在2 h内完成各指标检验。

1.5 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行分析：各数据正态性采用Kolmogorov-Smirnov法检验，符合正态分布的计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征曲线（receiver operation curve，ROC）评估PIVKA-II和D-二聚体对HCC患者发生PVTT的预测价值并计算其最佳截断值。采用Logistic回归分析HCC患者发生PVTT的危险因素。采用Spearman等级相关检验分析PIVKA-II与PVTT程氏分型等级的相关性。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 试验组和验证组的基线资料

试验组和验证组之间基线特征差异无统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 试验组和验证组的基线资料及比较

2.2 试验组和验证组内有PVTT与无PVTT之间比较分析

分别比较两组临床资料，伴有PVTT 的患者PIVKA-II、AFP、AFP-L3、D-二聚体水平高于无PVTT的患者，差异有统计学意义（表2，图2）。

图2 试验组和验证组有PVTT与无PVTT之间PIVKA-II的差异比较

表2 试验组和验证组内伴有PVTT与无PVTT之间临床资料比较

2.3 试验组中研究PIVKA-II和D-二聚体对HCC患者发生PVTT的预测价值并确定其最佳截断值

在试验组HCC 患者中，绘制ROC 曲线研究PIVKA-II和D-二聚体对合并PVTT的预测价值（图3）。PIVKA-II的ROC曲线下面积为0.747（95%CI0.652～0.842，P＜0.001），PIVKA-II预测HCC患者发生PVTT的最佳截断值为426.5 mAU/mL，敏感度为78.8%，特异度为69.8%；D-二聚体ROC曲线下面积为0.828（95%CI0.751～0.904，P＜0.001），D-二聚体预测HCC患者发生PVTT的最佳截断值为286 μg/L，敏感度为78.8%，特异度为77.8%；PIVKA-II与D-二聚体两者联合检测的ROC曲线下面积为0.861（95%CI0.791～0.932，P＜0.001），在PIVKA-II与D-二聚体各自最佳截断值下，两者联合预测HCC患者发生PVTT的敏感度为90.4%，特异度为57.1%。两者联合预测发生PVTT的敏感度较单一指标均有所提高，但特异度下降。

图3 试验组中PIVKA-II和D-二聚体对HCC患者发生PVTT的预测价值

2.4 验证组中验证PIVKA-II和D-二聚体对HCC患者发生PVTT的预测价值并验证其最佳截断值

为验证PIVKA-II和D-二聚体对HCC患者发生PVTT的预测价值并验证其上述最佳截断值，在验证组中通过绘制ROC曲线验证。PIVKA-II的验证组ROC曲线下面积为0.802（95%CI0.693～0.911，P＜0.001），将PIVKA-II以试验组中确定的426.5 mAU/mL为界，其预测HCC 患者发生PVTT 的敏感度为79.4%，特异度为69.0%；D-二聚体的验证组ROC曲线下面积为0.894（95%CI0.825～0.963，P＜0.001），将D-二聚体以试验组中确定的286 μg/L为界，其预测HCC患者发生PVTT的敏感度为88.2%，特异度为76.2%；在各自最佳截断值下，两者联合预测发生PVTT的敏感度为94.5%，特异度为57.1%，两者联合检测来预测PVTT的敏感度较单独检测有所提高。

2.5 HCC患者发生合并PVTT的危险因素分析

将本研究中伴有PVTT的HCC患者与无PVTT的HCC患者对比，单因素分析显示：PIVKA-II≥426.5 mAU/mL、AFP≥20 ng/L、AFP-L3 ≥10%、ALB≥30 g/L、ALT≥40 U/L、D-二聚体≥286 μg/L是发生PVTT的独立危险因素；多因素分析显示，PIVKA-II≥426.5 mAU/mL、D-二聚体≥286 μg/L是HCC患者发生PVTT的独立危险因素，见表3。

表3 HCC患者发生PVTT的单因素、多因素分析

2.6 合并PVTT的HCC患者血清PIVKA-II水平与PVTT的程氏分型等级呈线性相关

本研究共86 例伴有PVTT的HCC患者中，患者PVTT分型等级越高，其血清PIVKA-II水平也相应增高，两者呈线性相关（相关系数=0.400，P＜0.001），见图4。

图4 PIVKA-II水平与PVTT的程氏分型等级关系

3 讨论

由于肝脏解剖特点和HCC生物学特性，HCC极易侵犯肝血管系统，包括门静脉主干分支的大血管和肝段以上的小血管系统。PVTT是HCC常见的大血管侵犯形式，其发生率在HCC患者中占40%以上，发生PVTT的HCC患者预后极差[6]，及时诊断或预测PVTT是改善HCC患者预后的重点。本研究重点探究PIVKA-II与HCC患者发生PVTT的关系，研究发现，即使是在PIVKA-II水平普遍升高的HCC患者中，PVTT患者与无PVTT患者之间的PIVKA-II水平差异仍有统计学差异，虽然这种差异也体现在AFP和AFP-L3 上，但多因素分析显示仅PIVKA-II的差异有意义，这表明不仅是肿瘤本身，而且是PVTT与PIVKA-II的内在关联引起的PVTT患者PIVKA-II升高。目前关于PIVKA-II与血管侵犯的研究表明，PIVKA-II通过与生长因子受体c-Met结合并激活蛋白酪氨酸激酶1（JAK1）、VEGF、表皮生长因子受体（EGFR）等一系列下游信号通路，诱导HCC增殖和血管浸润，并导致MVI[7-8]。因此，用PIVKA-II预测PVTT具备理论基础，但其深入的内在相关肿瘤生物学机制仍待进一步研究。

PIVKA-II作为HCC的新一代肿瘤标志物，其优势正在逐步体现。临床上将PIVKA-II≥40 mAU/mL作为诊断HCC的标准，但尚无诊断或预测PVTT的标准。本研究发现PIVKA-II≥426.5 mAU/mL是HCC患者发生PVTT的独立危险因素，并且用该标准预测PVTT的灵敏度达78.8%。目前PVTT的诊断主要依靠CT、MRI等影像学检查，但由于影像学检查只能检测到肝叶门静脉分支以下的大血管PVTT，对于肝段及以上更细小的门静脉分支PVTT只能根据显微镜下的病理学检查，此外影像学检查普遍具有费用昂贵、易漏诊误诊等自身局限性，其诊断PVTT的敏感度仅在70%左右[9]，因此用PIVKA-II来协助诊断或预测PVTT具有临床价值。早在2007年，我国的程树群教授首次提出了PVTT的程氏分型，并为之后PVTT的相关研究奠定基础，目前临床上根据HCC患者的肿瘤和PVTT的大小、位置情况，采取对应的个性化治疗，如根治性手术、经肝动脉化疗栓塞（TACE）、射频消融、放疗、免疫靶向治疗等[10]，因此精准、有效、及时地评估HCC患者的PVTT情况十分重要。本研究发现，PIVKA-II的升高程度与PVTT程氏分型等级存在线性相关，提示PIVKA-II越显著升高的HCC患者，更需谨慎评估治疗PVTT，以减少相关并发症，改善患者预后。

国外的一项大样本回顾性研究表明，AFP≥20 000 ng/mL是诊断HCC合并PVTT的截断值，但其敏感度仅为24%，诊断效能并不理想[11]。HCC新型标志物miRNA的图谱研究表明，虽然miRNA可以提示HCC的静脉侵犯，但miRNA并不能诊断或预测PVTT的发生[12]。目前尚无诊断PVTT的特定肿瘤标记物，本研究从PIVKA-II的理论基础出发，研究PIVKA-II对PVTT的预测价值，旨在填补这一空缺。此外本研究发现作为反应血液高凝状态指标的D-二聚体也是PVTT形成的独立危险因素，可以与PIVKA-II联合预测PVTT。对于这一现象研究者认为，在PVTT形成过程中，门静脉局部血液呈高凝状态，从而引起D-二聚体的反应性升高。PIVKAII联合D-二聚体可以将预测PVTT的敏感度提高至90.4%，但特异度降至57.1%，考虑到延误诊治PVTT将导致不良后果，敏感度比特异度更为重要，应尽量提高预测PVTT的敏感度。因此，即便目前尚缺乏支持D-二聚体预测PVTT的理论依据，仍可将D-二聚体作为联合预测PVTT的补充指标，国外一项回顾性研究表明PIVKA-II、D-二聚体与PVTT相关联（以PIVKA-II≥221.3 mAU/mL为界，灵敏度为83.7%），其结果也支持本研究的结论[13]。

为确定PIVKA-II预测PVTT的最佳截断值并减少统计偏倚，本研究采取随机分组的内部验证思路方法，即先在试验组中计算得PIVKA-II ≥426.5 mAU/mL是预测PVTT的最佳截断值，并在验证组中验证其灵敏度为79.4%，证明该截断值的可靠性。该方法在类似研究中主要采取外部验证，但外部验证在本研究中并不适用，一是由于样本量的限制，二是由于本研究主要探讨PIVKA-II而非多种变量。研究者在表1 中将试验组和验证组的基线资料进行对比，以增加本研究随机分组内部验证的科学性。本研究为单中心回顾性研究，存在局限性，相关结果仍需多中心、大样本随机对照、外部验证进一步研究。

综上所述，HCC患者PIVKA-II≥426.5 mAU/mL是发生PVTT的独立危险因素，PIVKA-II具有良好的预测PVTT的价值。