藏药七味兔耳草散的质量控制*

刘安平，卜晨琛，马洁琼，苏媛，李维业，马秀玲，任东海，杨增亮

(1.西宁市食品药品检验检测中心，西宁 810000；2.青海省药品检验检测院，西宁 810000；3.青海省中医院，西宁 810000；4.青海省格尔木市药品管理服务中心，格尔木 816099)

七味兔耳草散，藏药名洒增屯巴，收载于《卫生部药品标准》(藏药)第一册1995年版[1]。处方由诃子、短穗兔耳草、熊胆粉、朱砂、姜黄、红花、手参7味原药材组成，功能与主治如下：补肾，涩精，用于“晶尼”病，肾虚引起的尿频、遗尿、遗精等[2-3]。七味兔耳草散在各级藏族医疗机构均有生产和使用。目前，质量控制项目仅有性状和检查，为了保证七味兔耳草散的质量及安全性，笔者在本研究增加朱砂、姜黄、红花、手参的显微鉴别；增加短穗兔耳草、诃子、红花、熊胆粉、姜黄的薄层色谱(TLC)鉴别；建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定没食子酸和木犀草素(短穗兔耳草)的含量[4-6]，报道如下。

1 材料

1.1仪器 Linomat 5全自动薄层色谱点样仪(CAMAG)，TLC Visualizer薄层色谱数码成像系统(瑞士CAMAG)，超声波清洗器B2500s-MT(上海必能信超声波清洗仪有限公司)，VIC-212电子天平(德国赛多利斯公司，感量：0.01 g)、BSA224SCW电子天平(德国赛多利斯公司，感量：0.01 mg)，硅胶G薄层板(默克公司)，Agilent1260高效液相色谱仪(安捷伦科技公司)，Agilent ZORBAX SB色谱柱(4.6 mm×250 mm)，Milli-QA超纯水器(美国Millipore公司)，Olympus BX53显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。

1.2试药 短穗兔耳草对照药材(青海省药检院标本馆提供)；诃子对照药材(批号：121015-201605)、红花对照药材(批号：120907-201713)、姜黄对照药材(批号：121188-201605)、熊去氧胆酸对照品(批号：110755-202005，含量：99.0%)、没食子酸对照品(批号：110831-201605)、木犀草素(批号：111520-202006，含量：94.4%)，均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.3样品 共收集七味兔耳草散样品10批次，批号分别为：20190412，20190413，20190414，20190210，20190201，20180506，20180512，20180610，20180912，20180913，其来源均为青海省各级民族医疗机构。

2 方法与结果

2.1显微鉴别 取本品粉末少许，制片，置显微镜下观察，朱砂：不规则细小颗粒暗棕红色，有光泽，边缘暗黑色；姜黄：薄壁细胞含油滴及红棕色色素；红花：花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约60 μm，外壁有齿状突起；手参：草酸钙针晶散在或呈束存在于黏液细胞中，见图1。

图1 七味兔耳草散粉末显微特征图Fig.1 Microscopic characteristics of Qiwei Tuercao San

2.2薄层鉴别 分别以短穗兔耳草对照药材、诃子对照药材、红花对照药材、姜黄对照药材、熊去氧胆酸对照品为对照，选用硅胶G薄层板进行分离，建立5项薄层色谱鉴别指标。

2.2.1诃子薄层鉴别 取样品粉末2 g，加乙酸乙酯50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液；取诃子对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；按处方制备缺诃子的阴性样品，同法制成诃子阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(7：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，105 ℃加热至斑显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。见图2。

1.阴性(诃子)；2.诃子对照药材；3-12.样品。图2 诃子的薄层色谱图1.negative (Terminalia chebula)；2.reference of Terminalia chebula；3-12 .sample.Fig.2 TLC of Terminalia chebula

2.2.2短穗兔耳草薄层鉴别 取样品粉末2 g，加乙醇50 mL，加热回流40 min，滤过，滤液蒸干，残渣加热水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液；取短穗兔耳草对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每毫升含木犀草素0.5 mg的对照品溶液；按处方制备缺短穗兔耳草的阴性样品，同法制成短穗兔耳草阴性样品溶液。吸取上述4种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(7：2.5：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药品和对照药材色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点，且阴性无干扰。见图3。

A.日光下检视；B.紫外光灯(365 nm)；1.木犀草素；2-3.短穗兔耳草对照药材；4-5.阴性样品；6-10.样品。图3 短穗兔耳草的薄层色谱图A.inspection in daylight B.inspection under ultraviolet lamp (365 nm)；1.luteolin；2-3. reference of Lagotis brachystachya；4-5.negative sample；6-10.sample.Fig.3 TLC of Lagotis brachystachya

2.2.3熊胆粉薄层鉴别 取样品粉末2 g，加乙醇10 mL超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加10%氢氧化钠溶液10 mL，加热回流2 h，放冷，滴加盐酸调节pH值至2～3，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液；取熊去氧胆酸对照品，加乙醇制成每毫升含0.5 mg的对照品溶液；按处方制备缺熊胆粉的阴性样品，同法制成熊胆粉阴性样品溶液。吸取供试品溶液、阴性溶液各10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷-乙醚-正丁醇-冰醋酸-水(10：5：3：5：1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，且阴性无干扰。见图4。

A.日光下检视；B.紫外光灯(365nm)；1.熊去氧胆酸对照品；2.阴性(熊胆粉)；3-12.样品。图4 熊胆粉的薄层色谱图A.inspection in daylight；B.inspection under ultraviolet lamp (365 nm)；1.reference substance of ursodeoxycholic acid；2.negative (Bear bile powder)；3-12.sample.Fig.4 TLC of Bear bile powder

2.2.4姜黄薄层鉴别 取样品粉末1 g，加无水乙醇10 mL，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液；取姜黄对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液；按处方制备缺姜黄的阴性样品，同法制成姜黄阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(96：4：0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，分别置日光和紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点，且阴性无干扰。见图5。

1.阴性(姜黄)；2.姜黄对照药材；3-12.样品。图5 姜黄的薄层色谱图1.negative (Curcumae longae rhizoma)；2.reference of Curcumae longae rhizome；3-12.sample.Fig.5 TLC of Curcumae longae rhizome

2.3含量测定

2.2.5红花薄层鉴别 取样品粉末2 g，加80%丙酮15 mL，超声处理10 min，滤过，滤液浓缩至5 mL，作为供试品溶液；取红花对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；按处方制备缺红花的阴性样品，同法制成红花阴性样品溶液；吸取上述三种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(6：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，放至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。见图6。

1.阴性(红花)；2.红花对照药材；3-12.样品。图6 红花的薄层色谱图1.negative (Carthami flos)；2.reference of Carthami flos；3-12.sample.Fig.6 TLC of Carthami flos

2.3.1色谱条件及系统适用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，0.3%磷酸为流动相B，进行梯度洗脱(0～13 min，A：3%，B：97%；>13～20 min，A：3%→40%，B：97%→60%；>20～40 min，A：55%，B：45%)；流率为1.0 mL·min-1；没食子酸检测波长为273 nm，木犀草素检测波长为350 nm。理论板数按没食子酸计不得低于2000。见图7。

A.对照品；B.样品；C.阴性(诃子)； D.阴性(短穗兔耳草)；1.没食子酸(273 nm)；2.木犀草素(350 nm)。图7 七味兔耳草散HPLC图A.reference substances ；B.sample； C.:negative(Chebulae fructus)；D.:negative(Lagotis brachystachya Maxim)；1.gallic acid(273 nm)；2.luteolin(350 nm).Fig.7 HPLC chromatograms of Qiwei Tuercao San

2.3.2对照品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，加50%甲醇制成每毫升含没食子酸30.78 μg的对照品溶液；取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每毫升含木犀草素10.47 μg的对照品溶液。

2.3.3供试品溶液的制备 取七味兔耳草散约1.2 g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声(功率250 W，频率35 kHz)处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失质量，摇匀，取续滤液，即得。

2.3.4线性关系考察 配制木犀草素对照品溶液为98.98 μg·mL-1，没食子酸对照品溶液为1.001 3 μg·mL-1。分别吸取2，5，8，12，20 μL，按“2.3.1”项条件分别注入色谱仪测定，以进样量对峰面积进行回归。没食子酸回归方程Y=97 576X+6.424，r=0.999 6，没食子酸在0.002 023～0.020 23 μg的范围内线性关系良好；木犀草素回归方程Y=8 248X+136.0，r=0.999 6，木犀草素在0.197～1.97 μg的范围内线性关系良好。

2.3.5精密度考察 取“2.3.2”项下对照品溶液重复进样5次，进样量10 μL，没食子酸、木犀草素峰面积RSD值分别为0.05%，0.09%，表明本方法精密度良好。

2.3.6稳定性实验 取“2.3.3”项下供试品溶液(批号：20190412)，分别在0，4，8，12，24 h进样，进样量10 μL，没食子酸、木犀草素峰面积的 RSD值分别为0.9%，0.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7重复性实验 取“2.3.3”项下供试品溶液(批号：20190412)5份，进样量10 μL，并分别计算出没食子酸、木犀草素的含量，RSD值均<2%，表明本方法重复性良好。

2.3.8加样回收率实验 取七味兔耳草散样品(批号：20190413)6份，每份取0.6 g，精密称定，置具塞容量瓶中，然后分别在每份样品中精密加入0.035 8 mg·mL-1木犀草素对照品溶液1 mL、0.401 7 mg·mL-1没食子酸对照品溶液1 mL，加入 50%甲醇定容至刻度，称定质量，超声(功率250 W，频率35 kHz)处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失质量，摇匀，取续滤液，即得。按“2.3.3”项下方法测定，计算加样加收率，结果见表2。

表2 七味兔耳草散的加样回收率实验结果Tab.2 Results of recovery test of Qiwei Tuercao San

2.4样品含量测定 取七味兔耳草散的样品10 批，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果Tab.3 Content determination results of samples mg·g-1

3 讨论

藏药中有许多地方习惯用药，所以会存在基源差异的问题，而七味兔耳草散处方中各原料药材基源准确，无争议。各原料药材的法定质量标准收载情况、药材基原和用药部位如下。①诃子、朱砂、姜黄、红花收载于《中华人民共和国药典》2020年版一部，诃子为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.或绒毛诃子TerminaliachebulaRetz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果实[6]；朱砂为硫化物类矿物辰砂族辰砂，主含硫化汞(HgS)[6]；姜黄为姜科植物CurcumaLonga L.的干燥根茎[6]；红花为菊科植物红花Carthamustinctorius L.的干燥花[6]。②短穗兔耳草收载于《青海藏药标准》1992 年版，为玄参科植物短穗兔耳草LagotisbrachystachyaMaxim.的干燥全草[7]。③熊胆粉收载于《中华人民共和国卫生部部标准》新药转正第十一册，为熊科动物黑熊SelenaretosthibetanusCuvier 胆囊手术引流胆汁而得的干燥品[8]。④手参收载于《卫生部药品标准》1995 年版(藏药第一册)，为兰科植物手参Gymnadeniaconopsea(L.)R.Br.的干燥块茎[1]。

笔者在本研究将七味兔耳草散中七味药材全部进行质量研究，可保障七味兔耳草散制剂的投料准确，对此药研究尚属首次。新增朱砂、姜黄、红花、手参的显微定性特征鉴别法，因其四味药中显微特征明显；新建立短穗兔耳草、诃子、红花、熊胆粉、姜黄的TLC定性鉴别法，鉴别特征明显、可行性良好、易操作、保障七味兔耳草散的质量安全。

在方法的选择和优化中，针对短穗兔耳草，本研究将诃子和短穗兔耳草的含量测定建立在一个HPLC系统中，采用双波长来分别测定没食子酸和木犀草素的含量，既方便快捷又经济环保。结果显示，没食子酸的含量在0.56～0.66 mg·g-1，木犀草素含量在0.05～0.07 mg·g-1，不同医疗机构间的样品存在一定的差异。