CircRNAs在骨质疏松症中的研究进展

张素华 徐月新

江苏省苏北人民医院妇产科，江苏 扬州 225001

正常成人骨骼由皮质骨和松质骨组成，其比例在不同部位有所差异，如椎骨以松质骨为主，长骨以皮质骨为主。骨重塑是新骨替代旧骨的过程，大约每十年骨骼会更新一次，主要是在旧骨的基础上，骨重塑单元招募破骨细胞进行骨吸收，随后成骨细胞进行骨形成和矿化，最终在新骨吸收腔内形成新骨。骨质疏松症一般是由于衰老引起骨重塑的速率改变，导致骨量丢失、骨微环境结构破坏等[1]。据估计，约30%年龄超过50岁的女性会经历一次骨质疏松导致的骨折，这是由于荷尔蒙水平变化及身体运动减少、破坏了骨重塑所引起的[2]。骨质疏松症的早期诊断比较困难，因此临床上迫切希望能够早日探索出一种灵敏度高、特异性好、方便性佳的新型生物标志物进行骨质疏松症的早期筛查和诊断。

1 circRNA的概述

早在20世纪70年代，借助电子显微镜就已经观察到了真核细胞细胞质中存在部分circRNAs，但当时被认为是异常剪接产生的“垃圾”[3]。后来研究[4]发现circRNAs是由前体mRNA通过反向剪接产生的单链共价闭合RNA分子。近年来随着高通量测序、多组学研究及生物信息学分析等飞速发展，已经鉴定出数千万种circRNAs，它们一般由一个或两个外显子反向剪接产生，这种环状结构不易被外切酶降解，比线性RNA更稳定。而且在外泌体、唾液及血清中都发现有circRNAs的表达，提示circRNAs可能是潜在的生物标志物及治疗靶点[5]。

1.1 circRNA的特征

目前高通量测序发现数万种circRNAs在哺乳动物组织中广泛表达，其中人体组织大约有3万个不同的circRNAs[6]。人体内circRNAs长度通常为几百个核苷酸左右，它们是一类由非标准剪接(即反向剪接)产生的非编码RNA，在这过程中下游的剪接供体位点与上游的剪接受体位点共价连接形成闭合环状结构。circRNAs这类转录本大多由2～3个外显子组成，也有只含内含子的circRNAs和同时包含内含子及外显子的circRNAs[7]。除了内含子circRNAs外，大部分circRNAs通常定位在细胞质。一般circRNAs的表达水平只有其相对应的线性转录水平的5%～10%，这是因为其反向剪接的效率较低，但是由于它们缺乏自由末端，不易被核酸外切酶(RNase R)降解，使部分circRNAs表达可以富集到较高水平[8]。circRNAs表达是一种古老的基因组特性，在数亿年进化中保持不变，它们可以在非常简单的生物体基因组表达，如酿酒酵母、阿米巴变形虫等，也可以在植物中表达，这些都是源于它们具有广泛的选择性剪接程序[9]。

1.2 circRNA的形成机制

circRNA依赖剪接体去除内含子并将外显子连接在一起，形成成熟的mRNA并催化线性mRNA前体剪接。circRNA通常需要一个外显子供体的剪接位点，但不与下游另一个外显子的受体剪接位点连接，而是与上游受体的剪接位点连接，这一过程称为反向剪接。剪接体选择哪些外显子进行环化的机制尚不完全清楚，但这个过程显然需要将反向剪接外显子侧面的两个内含子靠近。目前已知有3种机制可以实现这一步：①内含子配对驱动环化：主要成分是顺式作用元件(短非编码调控序列)，位于侧翼内含子内，使得侧翼内含子反向互补序列配对形成环状结构[10];②RNA结合蛋白(RBP)驱动环化:反式作用因子(结合顺式作用元件)识别并位于环状外显子侧面的内含子上，通过蛋白-蛋白相互作用或RBPs二聚化作用，使得剪接位点靠近，剪接小体参与反向剪接[11];③套索驱动环化：这一过程源于线性剪接，转录时RNA部分折叠与非临近外显子靠近，导致外显子跳跃，形成套索中间体进一步剪接产生[12]。

1.3 circRNAs 的生物学功能

2017年Science的一篇报道[13]为circRNAs 的生物学功能研究提供了重要的证据。研究[13]发现小鼠缺失circRNA(Cdr1as)会导致miRNA(miR-7)表达异常并影响脑内突触传递。虽然circRNAs表达量较少，但越来越多的研究发现它们在生理及病理条件下发挥着潜在的作用。它们通过不同的机制参与了基因表达调控：①circRNAs充当miRNA海绵：一些circRNAs可以与miRNA结合，以阻止miRNA与mRNA靶标的相互作用(即它们充当miRNA海绵)。比如Cdr1as广泛存在于哺乳动物大脑中并高度保守，且含有大量miR-7结合位点。在小鼠中敲除Cdr1as，会导致大脑中miR-7靶基因Fos表达显著升高[13]；②circRNAs可以结合RNA结合蛋白(RBPs)并介导RBPs的活性或定位。比如HuR可能与HeLa细胞中一半的circRNAs结合，HuR与circPABPN1的结合阻止了其与线性PABPN1 mRNA的结合，从而导致PABPN1转录翻译下降，细胞增殖减少[14]；③作为转录调节基因：尽管大部分circRNAs定位在细胞质中，但发现细胞核中的一些circRNAs参与了转录调控。比如EIciRNAs可以与U1snRNPs (U1 small nuclear ribonucleoproteins)相互作用形成复合物，并在其亲本基因启动子上与Pol II相互作用，增强基因表达[15]；④竞争其线性mRNA的剪接：circRNAs的生成会影响其宿主基因的表达，在果蝇中进行的研究发现，去除剪接体成分会导致circRNAs水平升高，而其线性mRNA水平降低。这是由于线性剪接和反向剪接通常使用相同的标准剪接受体和供体，所以circRNAs的产生会影响线性mRNA的生成[16]；⑤作为蛋白质合成的模板：它们主要位于细胞质且大多来源外显子，除了其非编码的功能，研究[17]发现circRNAs可能与核糖体翻译相关，并以依赖内部核糖体进入位点(IRES)进行翻译；⑥circRNAs是很有前途的生物标志物：环状结构使其在细胞内及细胞外(血浆、唾液等)中稳定存在[18]。提示疾病相关的circRNAs是具有潜力的生物标志物。

2 circRNAs与骨质疏松症发生相关

近年来circRNA是研究的热点，但是其在骨质疏松症中研究相对较少。circRNA通过直接参与骨相关的信号通路，形成circRNA-miRNA-mRNA轴，参与骨重塑过程。

2.1 circRNA与成骨细胞

成骨细胞是介导骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的形成、分泌及矿化，并进一步直接影响骨骼重塑。一般间充质干细胞可以分化形成成骨细胞，但这一过程需要一系列细胞外信号及转录因子的精细调控。Huang等[19]通过重组NELL-1诱导人脂肪干细胞成骨分化，并进行RNA测序发现了两个关键的circRNAs：circRFWD2和circINO80，敲除这两个circRNAs会影响其成骨分化进程。作为miRNA海绵作用，这两个circRNAs与hsa-miR-6817-5p相互作用，并调控其表达。Zheng等[20]诱导牙周韧带干细胞成骨分化，相较于第0天细胞，第3天细胞中有118个circRNAs差异表达，第7天细胞中有128个circRNAs差异表达，第14天细胞中有139个circRNAs差异表达。Peng等[21]在诱导上颌窦膜干细胞成骨分化中，发现circRNA_33287表达上调，并充当miR-214-3p海绵，发挥促进成骨分化的作用。Long等[22]筛选了小鼠脂肪基质细胞分化中差异表达的circRNAs，其中40种circRNAs表达上调，并发现miR-338-3p与mmu_circRNA_013422及mmu_circRNA_22566的表达上调相关联。Qian等[23]通过BMP2诱导小鼠前成骨细胞MC3T3-E1并得到1 581种差异表达的circRNAs，而且鉴定出circ19142和circ5846与该进程相关联。大量研究已经发现Cdr1as可以作为miR-7海绵参与多种生物进程，Li等[24]运用牙周韧带干细胞成骨分化并发现Cdr1as表达升高，体外实验发现Cdr1as通过抑制miR-7b表达，进一步调控GDF5表达及Smad1/5/8磷酸化等，促进细胞成骨分化。体内实验证明敲低Cdr1as会导致骨形成减少。Zhang等[25]发现在人间充质干细胞成骨分化中，存在1 505个circRNAs表达下调，而抑制circIGSF11的表达会相应的增加miR-199b-5p的表达，提示circRNA-miRNA相互作用影响了细胞成骨分化。Li等[26]对雌激素受体敲低的人骨髓间充质干细胞进行RNA测序，筛选出差异表达circRNAs共146种，并通过预测提示雌激素受体可能通过circRNA 2∶27713879∣27755789和circRNA 2∶240822115∣240867796-miR-328-5p-mRNA轴调控成骨分化。Du等[27]筛选出大鼠牙滤泡细胞成骨分化中差异表达的circRNAs共266种，其中circFgfr2通过miR-133/BMP6促进成骨分化。

2.2 circRNA与破骨细胞

破骨细胞是介导骨吸收的重要细胞，其增殖、分化及活性直接影响骨量改变。过度骨吸收会导致骨平衡被打破，进一步引起骨质疏松。Dou等[28]发现了RAW264.7破骨细胞生成的4个不同阶段差异表达的circRNAs共24种。Chen等[29]利用Rankl和CSF1诱导骨髓单核/巨噬细胞破骨生成，其中circRNA_28313表达明显升高，而在卵巢摘除小鼠中尾静脉注射Lsh-circRNA_28313会引起小鼠骨吸收减弱，骨量增加。

3 circRNA与骨质疏松症

由于骨质疏松症往往没有明显的临床表现，一般发生骨折后才进一步确诊。近些年不少研究通过研究骨质疏松性骨折案例，试图找寻新的早期诊断及治疗靶点。Ouyang等[30]针对骨质疏松性骨折患者中约5%的骨不连患者进行研究，发现患者骨髓间充质干细胞中存在差异表达的circRNAs，并证明了hsa_circ_0074834通过miR-942-5p调控了ZEB1和VEGF，进而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。通过裸鼠异位成骨及股骨单皮质缺损模型发现hsa_circ_0074834可以修复骨缺损。对20例绝经后骨质疏松症妇女血清circRNAs进行的分析[31]，发现387种circRNAs显著差异表达，其中circRNA_0016624表达下降，发现它是作为miR-98海绵，进一步调控了BMP2的表达。而另一项针对40例骨质疏松症病人血清进行的CircRNA芯片的研究[32]发现，其中circ_0006873和circ_0002060表达明显上调，并通过皮尔森关联分析了这两种CircRNA与骨质疏松临床特征的关系，从而确定circ_0002060是骨质疏松症诊断的分子标志物。一项对于28例绝经后骨质疏松症妇女外周血单核细胞(PBMCs)进行的CircRNA芯片研究[33]，运用荧光定量PCR及关联分析发现hsa_Circ_0001275是潜在的诊断分子标志物。针对3例绝经后骨质疏松症妇女外周血淋巴细胞(PBL)进行RNA测序，发现260种circRNAs差异表达[34]。见表1。

表1 骨质疏松症中CircRNA表达谱Table 1 CircRNA expression profiles in osteoporosis

4 讨论

circRNAs是分布广泛、结构稳定、功能复杂的RNA分子。虽然circRNA在癌症、神经系统发育及心脏疾病中取得较大的进展，但在骨质疏松症、骨关节炎等骨科疾病中的研究较少。目前大部分研究只是局限于circRNA芯片等表达谱的分析，缺乏circRNA调控成骨细胞、破骨细胞及骨质疏松症的机制研究。少数机制研究也是主要关注circRNA作为miRNA海绵调控这一生物进程。但是circRNA的功能多种多样，例如翻译的功能、转录调节功能都值得在骨质疏松症领域进行深入研究。

血液来源的生物标志物因其无创性，在癌症早期诊断、产前诊断方面都发挥着重要作用。目前已经报道circRNA在骨质疏松症病人血液中差异表达，当然这里涉及了血清、血浆、外周血单核细胞及外周血淋巴细胞等，多方面阐释了circRNA做为骨质疏松症生物标志物的巨大潜力。当然这只是刚开始，虽然有研究已经利用异位成骨及骨缺损模型研究circRNA在骨质疏松症中的作用，但是完善circRNA在动物方面的研究大势所趋，包括骨质疏松症动物模型构建、转基因动物等。从临床出发最终还是要回归临床，扩大骨质疏松症样本进行临床验证。

总而言之，这些研究虽然证实了circRNA在骨发育方面的作用及其作为骨质疏松症生物标志物的价值，但在临床常规开展及个体化治疗方面，仍需进一步实验研究，希望获得能直接反映骨骼形成及骨结构的变化。未来一方面应进一步深入对于circRNA在骨质疏松症中的机制研究，另一方面应继续探讨将其作为临床筛查及诊断标志物的可能性。