肌少-骨质疏松症大鼠模型的建立

马江涛 黄佳纯 黄润龙 万雷 黄红 黄宏兴*

1.广州中医药大学，广东 广州 510405 2.广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室，广东 广州 510006 3.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510375 4.广州中医药大学护理学院，广东 广州 510006

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量降低、骨微结构损害及骨脆性增加为特征的骨骼系统疾病[1]，肌少症(sarcopenia，SP)或肌肉衰减综合征是以肌力、肌量或肌肉功能下降为特征的肌肉系统疾病[2]。当OP和SP共存时，称之为肌少-骨质疏松症(osteosarcopenia，OS)[3-6]，即OS同时具有OP和SP的临床特征。由于目前国内外对OS的诊断标准存在争议，因此文献报道的发病率各不相同。Huo等[7]对680名有跌倒史的老年人进行流病学研究，发现OS的患病率为37%，且这些患者更易有其他合并症，运动能力受损和抑郁风险也较高。Yoo等[8]对324例髋部骨折的老年患者研究发现，OS患者1年死亡率(15.1%)显著高于仅患OP(5.1%)或SP(10.3%)者。OP引起的脆性骨折(如髋关节骨折、腰椎骨折和桡骨远端骨折等)和SP引起的运动功能障碍、跌倒等相互作用，使OS患者致残致死率显著提高，因此，研究OS的发病机制及防治策略已迫在眉睫。然而相比于OP或SP，目前OS的动物模型构建方法报道较少，现有的研究或利用转基因衰老性小鼠或老龄鼠构建本病动物模型。本研究基于前期研究基础，应用复合造模法构建OS大鼠模型，以期为OS的基础研究提供动物模型载体，为研究OS的病因病机及防治策略提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物：SPF级雌性未孕6月龄SD大鼠40只，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：No.44005800009826。实验在广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室(温度20 ℃～26 ℃，湿度40%～70%，每天交替光照12 h)进行，喂食大鼠专用普通饲料及无菌用水。

1.1.2药品：地塞米松磷酸钠注射液(三才石岐制药股份有限公司，国药准字H44025148，批号20190350)，注射用青霉素钠(山东鲁抗医药股份有限公司，国药准字H37020080，批号190405)。

1.1.3仪器：YLS-13A型大小鼠抓力测定仪(济南益延科技发展有限公司)；Discovery A型双能X线骨密度仪(美国Hologic公司)；micro CT仪(比利时Scanco Medical)。

1.2 方法

1.2.1动物分组、造模及给药：40只SPF级健康雌性未孕6月龄SD大鼠在实验开始之前自由摄取标准动物饮食，适应环境1周，然后利用Excel表格的Rand函数按体重随机分层分组，共分5组，即正常组(Control)、假手术组(Sham)、假手术+地米组(Sham+DXM)、去势组(OVX)、去势+地米组(OVX+DXM)，每组8只。OVX组、OVX+DXM组均采用大鼠背侧入路双侧卵巢切除法[9]切除大鼠双侧卵巢，逐层缝合肌肉和皮肤。Sham组、Sham+DXM组切除卵巢附近等体积大小的脂肪组织后逐层缝合肌肉和皮肤。术后除Control组外，各组大鼠给予青霉素钠8万单位/只肌肉注射，每天1次，连续3 d。各组大鼠术后恢复一周，一周后分别对Sham+DXM组、OVX+DXM组大鼠腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液(DXM)1 mg/(kg·d)，连续2周。术后3个月麻醉处死各组大鼠，检测相关指标验证造模成功。

1.2.2抓力检测：造模后3个月，使用YLS-13A大小鼠抓力仪测定大鼠前肢抓力(grip)。测试前让大鼠在抓力仪上适应10 min，然后抓住大鼠尾巴，确定大鼠抓牢后，平稳地向后拉，记录仪器上的最大抓力读数。测定3次并记录，用3次抓力的平均值作为反映前肢肌肉力量的指标。

1.2.3双能X线骨密度仪(DXA)检测：造模后3个月，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，用DXA“小动物”模式中“大鼠全身”和“区域高分辨率”分别测量大鼠全身骨密度(BMD)、股骨BMD、全身瘦肉量和四肢瘦肉量等。根据相关OP指南[9-11]，将全身、股骨等BMD作为确定OP的诊断方法。根据欧洲肌少症工作组(EWGSOP)、亚洲肌少症工作组(AWGS)和国际肌少症工作组(IWGS)的标准[12-13]，测量大鼠四肢瘦肉量及全身瘦肉量，将相对骨骼肌质量指数(relative skeletal muscle index，RSMI)定义为四肢瘦肉量(appendicular lean mass，ALM)/体重(body weight，BW)，将骨骼肌质量指数(skeletal muscle index，SMI)定义为全身瘦肉量(lean mass，LM)/BW，以大鼠前肢抓力、RSMI和SMI作为确定SP的诊断方法。

1.2.4Micro CT检测：麻醉处死大鼠后，完整分离大鼠左侧股骨，剔除股骨周围附着的肌肉等软组织，多聚甲醛固定，生理盐水浸泡。测量离体左侧股骨BMD后进行Micro CT扫描。通过仪器自带分析软件(CTAn)框取松质骨，选择股骨远端生长板上方1 mm的松质骨作为感兴趣区，分析骨体积分数(percent bone volume，BV/TV，%)、骨表面密度(bone surface density，BS/TV，mm-1)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th，mm)、骨小梁数(trabecular number，Tb.N，mm-1)和骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp，mm)，并通过仪器自带分析软件(CTvox)重构股骨远端三维图像。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计分析软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，所有数据先进行正态性与方差齐性检验。若方差齐，组间两两比较采用LSD法。若方差不齐，先行Welch(W)校正检验，然后用Dunnett’s T3(3)法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

实验过程中，Sham+DXM组大鼠因麻醉引起肠梗阻死亡1只，OVX+DXM组大鼠因腹腔注射时注射器针尖刺穿肠道死亡一只，最终纳入研究的动物数量为38只。

2.2 各组大鼠抓力

造模3个月后，对大鼠前肢抓力进行检测。与Control组[(1 120.06±206.71) g]相比，Sham组[(1 114.08±130.57) g]大鼠前肢抓力无明显变化(P>0.05)。与Sham组相比，Sham+DXM组[(927.05±177.72) g]、OVX组[(796.78±168.49) g]和OVX+DXM组[(706.33±138.55) g]大鼠前肢抓力明显下降(P<0.05)，其中OVX+DXM组大鼠前肢抓力下降最明显，而OVX组大鼠前肢抓力其次。与Sham+DXM组相比，OVX+DXM组大鼠前肢抓力下降。与OVX组相比，OVX+DXM组大鼠前肢抓力有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 DXA检测

与Control组相比，Sham组大鼠全身BMD、股骨全段BMD无明显变化(P>0.05)。与Sham组相比，Sham+DXM组大鼠全身BMD、股骨全段BMD无明显变化(P>0.05)，说明DXM腹腔注射[1 mg/(kg·d)]不会引起大鼠发生骨质疏松。与Sham组相比，OVX组和OVX+DXM组大鼠全身BMD、股骨全段BMD均下降(P<0.05)，且OVX+DXM组大鼠下降更明显，说明OVX组和OVX+DXM组大鼠均发生骨质疏松，其中OVX+DXM组大鼠骨质疏松似乎更严重，但两组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠全身及股骨全段BMD比较Table 1 BMD of the whole body and femur in each

与Control组相比，Sham组大鼠SMI、RSMI无明显变化(P>0.05)。与Sham组相比，Sham+DXM组大鼠SMI、RSMI明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，说明DXM腹腔注射可以引起大鼠骨骼肌肌量下降。与Sham+DXM组相比，OVX组、OVX+DXM组大鼠SMI、RSMI明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比，OVX+DXM组大鼠SMI、RSMI明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，说明大鼠SMI、RSMI可以区分两组大鼠骨骼肌肌量变化，证明造模成功。见表2。

表2 各组大鼠骨骼肌质量指数和相对骨骼肌质量指数Table 2 Skeletal muscle mass index and relative skeletal muscle mass index of rats in each group

2.4 Micro CT检测

与Control组相比，Sham组大鼠股骨远端BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp无明显变化(P>0.05)，BS/TV下降(P<0.05)。与Sham组相比，Sham+DXM组大鼠股骨远端BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp无明显变化(P>0.05)，仅BS/TV提高(P<0.05)，说明DXM腹腔注射对股骨远端骨微结构影响不大。与Sham+DXM组相比，OVX组、OVX+DXM组大鼠股骨远端BV/TV、BS/TV、Tb.N明显下降，Tb.Sp明显提高(P<0.05)，Tb.Th差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠离体股骨远端骨微结构Table 3 Bone microstructure of isolated distal femur of rats in each group

如图1所示，Comtrol组、Sham组和Sham+DXM组股骨远端骨微结构无明显差别。与前三组相比，OVX组、OVX+DXM组股骨远端骨量明显下降，骨小梁稀疏，骨小梁数目和厚度明显下降，骨小梁分离度明显增加，这与上述骨微结构检测指标相一致。

3 讨论

OS是以肌力、肌量、肌肉功能下降、BMD降低和骨微结构损害为特征的肌肉骨骼系统疾病[6]。肌肉骨骼位置毗邻，联系密切，相互影响。肌力下降，肌肉功能受损，跌倒风险增加，同时肌纤维对骨细胞的生物力学刺激降低，引起骨质疏松；肌量下降，肌细胞分泌的细胞因子减少，这些细胞因子不仅可以通过自分泌影响自身，而且通过旁分泌影响紧邻的骨细胞，可能加重骨质疏松。BMD降低，骨脆性增加，引起骨折风险增加；骨量下降，骨细胞分泌的细胞因子不仅通过自分泌影响自身，而且通过旁分泌影响肌肉[14-18]。因此，OS患者跌倒、脆性骨折及死亡风险更高，其发病机制远比单一的SP或OP更复杂。然而，目前针对本病的研究仅仅停留在起步阶段，局限于临床研究[7-8,19-23]，基础研究少见。本研究基于前期研究基础，通过复合造模法构建本病动物模型，并尝试确定本病的诊断标准，为后续深入研究提供理论基础。

目前，OS暂无较成熟的造模方法。国外学者[24]尝试利用10月龄SD雌性大鼠去卵巢构建OS模型，但这种方法存在动物饲养周期长、老龄大鼠易死亡、评价指标片面等问题，并不能有效区分SP和OP。

目前构建OP模型有多种方法[25-28]，包括手术诱导法、药物诱导法、失用诱导法、饮食诱导法、基因敲除法和自然退变法等。其中较理想的OP动物模型应具有模型稳定、可操作性强、造模周期短、重复性高、应用广泛、经济实用等优点。研究证实[26]，雌性SD大鼠经手术切除双侧卵巢后，体内雌激素水平骤然下降，使促黄体素和促卵泡素分泌量增加，从而影响骨代谢，骨吸收远远高于骨形成，骨量丢失严重，从而导致了OP。该模型已成为国内外研究绝经后OP的“金标准”，也是WHO和FDA推荐的研究绝经后OP的最佳模型。

目前构建SP模型的方法相对较少。常岑等[29-30]对SD大鼠腹腔注射DXM注射液，连续2周，成功构建大鼠骨骼肌萎缩模型。鲁飞翔等[31-33]对小鼠皮下注射DXM注射液，连续6周，成功构建小鼠SP动物模型。DXM属于糖皮质激素，具有抗炎、抗过敏和抗休克的功效，但长期注射会导致体重增加、肌肉萎缩、脂肪向心性堆积等不良反应。DXM是糖皮质激素中效价最高且作用持续时间最长的一种激素类药物，因此利用DXM建立SP动物模型具有周期较短且效果明显等优点，并且这种动物模型能较为真实的模拟人类短期应用激素后引起的肌肉萎缩。除了注射DXM，高脂饲料喂养大小鼠，也可构建SP动物模型[34]。但这种方法普遍存在造模周期长(最长14周)、喂养成本大、高脂饲料配方不统一等问题，难以广泛应用。

综合上述OP和SP的造模方法，结合本课题组前期研究基础，本研究利用6月龄雌性未孕去势大鼠联合腹腔注射DXM，构建OS大鼠模型。这种造模方法具有造模周期短(3个月)、模型稳定、可操作性强、成本低等优点，可以较为真实地模拟OS。

OS目前全球尚无统一的诊断标准，但确诊该病必须同时满足SP和OP的诊断标准。OP主要以腰椎、股骨和全髋BMD等为诊断依据。SP主要以肌量、肌力和肌肉功能为诊断依据[12-13]。肌量测量常采用双能X线吸收仪(DXA)和生物电阻抗(BIA)等方法测量全身SMI和RSMI，肌力测量评价优势手的握力，肌肉功能测量评价正常步速。基于此，为确定OS大鼠模型的诊断标准，本研究以大鼠前肢抓力作为评价大鼠肌力的指标，以大鼠SMI和RSMI来评价大鼠肌量，以大鼠全身BMD和股骨BMD来评价大鼠骨量，并进一步用Micro CT定量评价大鼠股骨远端骨微结构，同时构建三维图形，为OS大鼠模型的诊断提供诊断学依据。

结果表明，造模后3个月，与Control组和Sham组相比，Sham+DXM组大鼠前肢抓力明显降低，SMI和RSMI明显下降，全身BMD、股骨全段BMD和股骨远端骨微结构无显著变化，表明腹腔注射DXM[1 mg/(kg·d)]引起大鼠发生SP，而不引起大鼠发生OP。与Control组、Sham组和Sham+DXM组相比，OVX组和OVX+DXM组大鼠前肢抓力明显下降，SMI和RSMI明显下降，全身BMD和股骨全段BMD明显下降，股骨远端骨微结构破坏严重，表明去势、去势联合地米均可引起大鼠发生OS，但去势联合地米较单纯去势在降低SMI和RSMI方面作用更强烈(见表2)。

综合以上研究结果，去势联合腹腔注射DXM法可以建立OS大鼠模型，这种复合造模法具有造模周期短(3个月)、模型稳定、可操作性强、成本低等优点，可以较为真实地模拟OS。OS大鼠模型的评价指标包括前肢抓力、SMI和RSMI、全身BMD和股骨BMD、股骨远端骨微结构等，这些指标具有测量简单、方便操作、分辨率高等优点，对于本病的诊断具有较高的诊断价值。