基于BMP-2/SMAD/Runx2通路探究骨化三醇胶囊对大鼠胫骨骨折愈合的影响

王皓 凃峰 赵文斌 张麟

武汉市第一医院骨科，湖北 武汉 430022

胫骨骨折为临床常见骨折类型之一，伴随疼痛、日常活动受限等，不仅影响患者生活质量，还给家庭和社会造成一定负担[1]。近年创伤性骨折和骨质疏松性骨折的发病率逐年上升[2]，而骨折愈合病理过程较为复杂，涉及间充质干细胞的趋化性和积累、成骨细胞的分化、成熟以及细胞外基质的形成和血管生成等[3]。其中，成骨细胞分化和成熟是骨形成的基础，在骨折愈合过程中发挥重要作用。骨形态发生蛋白2(BMP-2)/SMAD/Runt相关转录因子2(Runx2)信号通路的激活为成骨细胞分化和成熟所必需，在促进骨形成和骨愈合过程中发挥重要作用[4]，因此BMP-2/SMAD/Runx2通路可能是骨折治疗的潜在靶标。骨化三醇胶囊(Cal)的活性成分为维生素D3羟化代谢物，可通过与维生素D受体结合促进消化道等对钙的吸收，刺激成骨分化、提高骨组织密度、促进新骨形成，临床已用于骨质疏松等疾病的治疗[5-6]。陈晓婷等[7]研究显示，Cal可促进间充质干细胞在BMP诱导下的成骨分化作用。本研究通过构建胫骨骨折大鼠模型，研究Cal对骨折愈合的影响并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6月龄SPF级SD大鼠，体重320～340 g，购买自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCXK(粤)2018-0002]。该研究经武汉市第一医院动物伦理委员会批准(批号：No.0016014)，所有实验在3R原则下进行。

1.2 试剂及仪器

1.2.1试剂：骨化三醇胶囊(规格：0.5 μg)购自正大制药有限公司；BMP特异抑制剂Noggin(规格：10 μg，纯度>97%)购自Abbexa公司；大鼠碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型前胶原N-端肽(PINP)及骨钙素(OCN)ELISA试剂盒购自生工生物公司；小鼠抗BMP-2、Runx2购自Santa cruz公司；马抗小鼠、羊抗兔辣根过氧化物酶IgG及β-actin抗体购自CST公司；兔抗SMAD1/5/8购自OriGene公司；兔抗p-SMAD1/5/8购自MilliporeSigma公司，等。

1.2.2仪器：蛋白转印系统、电泳仪购自BioRad公司；小动物显微断层扫描仪购自Scanco Medical公司；光学显微镜购自Olympus公司；全自动生化分析仪购自Roche公司,等。

1.3 方法

1.3.1胫骨骨折模型制备及分组：根据文献制备胫骨骨折模型[8-9]：腹腔注射2.0%戊巴比妥钠(40 mg/kg)将大鼠麻醉、固定在手术台上，在左下肢胫骨外侧作一纵向切口(约1.5 cm)，逐层剥离皮肤、胫前肌，暴露胫骨中段，打孔后将克氏针完全插入胫骨骨髓腔中，进行髓内针闭合固定；于胫骨结节下约0.5 cm处以骨剪横向截断胫骨，形成骨折，冲洗后逐层缝合。术后连续3 d，每日给予青霉素腹腔注射以预防感染。术后立即对大鼠进行X光检查，造模成功大鼠可见明显骨折线。将39只胫骨骨折大鼠按随机数字法分为胫骨骨折组、Cal组、Cal+Noggin组，每组13只，依次给予灌胃生理盐水、灌胃10 ng/mL Cal溶液[10]、灌胃10 ng/mL Cal溶液+骨折处经皮注射50 ng/mL Noggin溶液[11]，灌胃体积10 mL/(kg·d)，注射体积2 mL/(kg·d)，另取13只正常大鼠不进行手术，仅灌胃和注射等量生理盐水，作为对照组(Cont)组，共给药4周。

1.3.2血清成骨相关因子检测：末次给药24 h后，腹腔注射过量戊巴比妥钠(100 mg/kg)处死实验动物，腹主动脉取血(每组取10只)，分离血清保存在-80 ℃。按说明书将血清与相应试剂盒试剂混匀后，采用全自动生化分析仪检测ALP、OCN、PINP水平。分离留取各组大鼠左侧胫骨，剔除附着的肌肉等软组织，自近心端取出胫骨内的克氏针，用于后续检测。

1.3.3X射线检测：将1.3.2中胫骨样本放在X射线照射平台上进行拍照，参数设置为：40 kV电压、10 mA电流、标本距X射线管45 cm、曝光0.06 ms。

1.3.4微型计算机断层扫描(micro CT)检测：将1.3.2中胫骨样本放在专用圆筒中固定，参数设置为：70 kVp X射线、每180°采集1 000个图像。利用机器自带的CT评价程序对骨折断端新生骨痂组织进行分析，获得三维图像和骨痂形态学参数：骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁分离度(TB.SP)、骨小梁数量(TB.N)、骨小梁厚度(TB.TH)及从结构模型指数(SMI)，以评价新生骨质的微观结构。

1.3.5HE染色：将1.3.2中胫骨样本固定后(每组取3只)，在0.5 mol/L EDTA溶液中放置4周脱钙。脱钙、常规脱水等处理后包埋在石蜡中，从骨折断端处开始冠状切片(5 μm/片)，经苏木素染液孵育10 min、盐酸-乙醇分化20 s、PBS脱色40 s、伊红染液孵育1 min后封片，光学显微镜下观察断端处组织形态。

1.3.6Western blot检测蛋白表达：取出1.3.2中断端骨痂组织和Cont组骨膜组织(每组取10只)加入蛋白裂解液提取骨组织中蛋白质并采用BCA法测定浓度。取25 μg加入5×SDS缓冲液煮沸，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、将蛋白转印至PVDF膜、5%牛奶封闭、一抗(包括BMP-2、SMAD1/5/8、Runx2、p-SMAD1/5/8、β-actin)4 ℃孵育过夜、二抗室温孵育40 min后，将PVDF膜放入增强化学发光液中显影后拍照。根据蛋白条带的灰度值分析其相对表达量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 Cal对胫骨骨折大鼠骨愈合的影响

Cont组无骨折线。胫骨骨折组、Cal+Noggin组骨折线较为明显，出现少量新生骨痂；Cal组骨折线几乎不可见，有大量新生骨痂。见图1。

图1 胫骨X射线图Fig.1 X-ray image of the tibia注：箭头所指为骨折处。

2.2 Cal对胫骨骨折大鼠新生骨痂微结构的影响

相较于Cont组，胫骨骨折组骨密度、骨小梁数量及厚度、骨体积分数、SMI均增高，骨小梁分离度降低(P<0.05)；相较于胫骨骨折组，Cal组骨密度、骨小梁数量及厚度、骨体积分数、SMI均增加，骨小梁分离度降低(P<0.05)；相较于Cal组，Cal+Noggin组骨密度、骨小梁数量及厚度、骨体积分数、SMI均降低，骨小梁分离度增加(P<0.05)。见图2、表1。

图2 胫骨micro CT扫描图Fig.2 Micro-CT scan of the tibia

表1 4组大鼠骨密度和骨微结构比较Table 1 Comparison of bone density and bone microstructure among the 4

2.3 Cal对胫骨骨折大鼠断端组织形态的影响

Cont组不可见软骨细胞和成骨细胞。胫骨骨折组、Cal+Noggin组骨折断端周围可见非肥大的软骨细胞，断端间隙中有少量成骨细胞。Cal组骨折断端周围可见致密肥大的软骨细胞、新形成的骨小梁，间隙中有大量成骨细胞。见图3。

图3 胫骨断端组织HE染色图(100×)Fig.3 HE staining image of stump tissue of the tibia (100×)注：黑色箭头为软骨细胞，白色箭头为成骨细胞

2.4 Cal对胫骨骨折大鼠成骨因子水平的影响

相较于Cont组，胫骨骨折组ALP、OCN、PINP水平增加(P<0.05)；相较于胫骨骨折组，Cal组ALP、OCN、PINP水平增加(P<0.05)；相较于Cal组，Cal+Noggin组ALP、OCN、PINP水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 4组大鼠成骨因子水平比较Table 2 Comparison of the levels of osteogenic factors among the 4

2.5 Cal对胫骨骨折大鼠骨痂中BMP-2、SMADs及Runx2蛋白表达的影响

相较于Cont组，胫骨骨折组BMP-2、Runx2及p-SMAD1/5/8/SMAD1/5/8表达增高(P<0.05)；相较于胫骨骨折组，Cal组上述BMP-2等表达增高(P<0.05)；相较于Cal组，Cal+Noggin组上述BMP-2等表达减低(P<0.05)。见图4、表3。

表3 4组大鼠BMP-2、SMAD1/5/8、p-SMAD1/5/8、Runx2蛋白表达比较Table 3 Comparison of BMP-2, SMAD1/5/8, p-SMAD1/5/8, and Runx2 protein expression among the 4

图4 BMP-2、SMAD1/5/8、p-SMAD1/5/8、Runx2蛋白印记图Fig.4 The imprinting maps of BMP-2, SMAD1/5/8, p-SMAD1/5/8, and Runx2 protein注：A：Cont组，B：胫骨骨折组，C：Cal组，D：Cal+Noggin组

3 讨论

骨折发生后，破骨细胞迁移到损伤处将受损和死亡骨细胞吸收，为新骨形成提供前提；然后成骨细胞迁移到损伤处，分泌新骨基质，形成新骨并促进骨结合和骨连接[12]。抑制破骨细胞或成骨细胞分化，可造成骨愈合延迟或骨不愈，本研究主要从成骨分化和成熟的角度，分析Cal在骨折愈合中对骨形成的调节作用。

骨折大鼠在无药物干预时，第6周后骨密度逐渐增加，骨小梁逐渐增多，骨形成及吸收代谢活动活跃，Runx2、BMP等达到峰值[13]。为观察到药物作用，本研究在第4周取样，此时骨折组大鼠骨折线明显，出现少量新生骨痂，骨折断端新生骨痂的骨小梁分离度较低，骨小梁增多增厚，骨体积分数、骨密度及SMI增高，表明骨折第4周骨组织出现自我愈合，但骨痂形成较少，骨微结构不完整。骨形成是骨折愈合的前提，血清中的ALP、PINP、OCN等可衡量机体骨形成。本研究中，骨折模型组大鼠ALP、OCN、PINP水平高于Cont组，表明骨折后骨形成增加，这由于机体骨组织具有一定自我愈合能力。李颂兵等[14]报道，Cal可提高绝经后骨质疏松女性骨密度，减轻腰背疼痛感。廖腾等[15]发现，Cal可明显提高抗旋髓内钉固定的股骨骨折患者的骨密度，促进骨形成。本研究结果显示，给予Cal治疗的大鼠骨折线几乎不可见，断端周围可见致密肥大的软骨细胞，新生骨痂及骨小梁增多，骨小梁厚度、骨体积分数及密度、血清PINP、ALP、OCN水平及SMI均高于骨折模型组，骨小梁分离度低于骨折模型组，表明Cal可促进骨折大鼠新生骨痂中骨量增加、骨微结构成熟及骨折愈合。

转化生长因子超家族中的BMP-2具有较强的促成骨分化作用，一方面，BMP-2被细胞膜上受体识别，激活丝氨酸/苏氨酸激酶等，促进SMAD1/5/8被磷酸化为p-SMAD1/5/8，与SMAD4形成复合物后移至细胞核，启动经典的BMP-2/SMAD成骨信号[4]。另外，BMP-2还可启动Runx2等转录因子表达，进而启动关键成骨细胞特异性基因(包括ALP、OCN等)转录翻译[16]。研究显示，沉默BMP-2的拮抗剂Gremlin2，可通过促进BMP-2/Smad/Runx2通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，且在动物实验中得到验证[17]。多种药物可通过激活BMP-2/SMAD/Runx2通路促进骨折愈合[18-19]。本研究结果显示，骨折模型组大鼠新生骨痂中BMP-2、Runx2及p-SMAD1/5/8/SMAD1/5/8表达较Cont组增高，表明骨折后骨组织中BMP-2/SMAD/Runx2通路被活化，可能与成骨细胞活化有关。Cal作为维生素D补充剂，可促进机体对钙磷的吸收，调节钙磷稳态[20]。近年研究指出，含Cal的微孔多糖复合支架可促进骨质疏松大鼠的成骨作用，促进骨再生[21]。本研究观察到Cal治疗后新生骨痂中BMP-2、Runx2及p-SMAD1/5/8/SMAD1 /5/8表达较骨折组进一步增高，表明Cal可促进骨组织BMP-2/SMAD/Runx2通路活化。本研究还发现，Cal对骨折大鼠骨密度及新生骨痂微结构的改善作用，可被BMP-2特异性抑制Noggin逆转，进一步表明Cal可能通过激活BMP-2/SMAD/Runx2通路，诱导成骨分化，促进骨折愈合。

综上所述，Cal可能通过激活BMP-2/SMAD/Runx2通路，诱导成骨分化，改善新生骨痂骨密度及微结构，促进骨折愈合。然而Cal对骨折愈合的促进作用还可能涉及破骨细胞分化等其他机制，值得进一步探究。