长链非编码RNA对胰腺癌侵袭转移分子机制的影响

徐 建， 潘燕妮， 刘欣原， 江建新

武汉大学人民医院 肝胆外科， 武汉 430061

胰腺癌是消化系统中恶性程度最高的肿瘤之一，其5年总生存率不足5%[1]。根治性手术是治疗胰腺癌的主要手段，但临床中能行根治性切除胰腺癌患者不足20%，且术后易复发或转移。尽管近些年来胰腺癌的治疗手段逐渐多样化，但临床疗效及总生存率仍未得到明显的改善[2]。目前，临床中仍缺乏胰腺癌早期诊断的有效标志物，因此，如何在胰腺癌早期揭示其发生、发展的分子机制，探索精准的胰腺癌早期诊断标志物和潜在靶点具有重要的理论意义和临床应用价值[3]。随着转录组测序和基因芯片技术的发展，可通过基因表达失调导致信号通路异常调控和肿瘤微环境改变等多个方面探索胰腺癌发病机制。近年来，长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)因具有多种靶向调控功能越来越受到关注，它可以作为信号分子靶向调控基因的特异性表达，引导蛋白质分子形成蛋白复合物以及作为诱饵分子调节蛋白或RNA相关作用。因此，探讨lncRNA通过不同调控模式和途径参与胰腺癌侵袭转移的分子机制，对胰腺癌诊断、治疗及预后具有重要意义[4-5]。

1 lncRNA概述

lncRNA是一种长度超过200个核苷酸不编码蛋白质的RNA，广泛存在于生物体内，由于编码蛋白质的缺失曾被认为是基因表达转录中的“垃圾”[6]。但越来越多的研究[7]证明，lncRNA在重塑染色质和基因组结构、RNA稳定和转录调控中的起着至关重要的作用。lncRNA可参与基因的转录及转录后调控，并参与基因的表观遗传修饰；同时lncRNA还可参与调控后翻译过程，充当海绵作用与microRNA(miRNA)结合，协同调节mRNA的表达[8]。目前，有研究[9]发现，lncRNA PVT1在胰腺癌中可与MYC启动子结合，通过全基因组分析手段可将lncRNA PVT1作为胰腺癌早期诊断的标志物。现已证实异常表达的lncRNA在胰腺癌发生上皮间充质转化(EMT)中发挥重要功能，它可通过调控胰腺癌细胞铁死亡、自噬及外泌体等多途径影响其发生侵袭转移；同时lncRNA还可被M6A调控进而影响胰腺癌的恶性生物学行为[4-5,10-11]。

2 lncRNA参与胰腺癌EMT过程

EMT是具有上皮特征的细胞向间充质细胞发生转变的一个可逆生物学过程，也是恶性肿瘤发展过程中的关键生物学过程[12-13]。当胰腺癌细胞发生EMT时，肿瘤细胞间黏附能力逐渐减弱，有利于向四周发生浸润和远处转移，使得胰腺癌细胞获得更强的侵袭和转移能力。lncRNA作为参与EMT发生过程中的主要调控因子之一，它可通过激活相关信号通路(如Wnt/β-catenin、Notch、TGFβ、AKT等)来参与胰腺癌细胞侵袭和转移过程[14]。

lncRNA能通过多种调控方式参与胰腺癌的EMT过程。有研究[15]报道胰腺癌中PANC-1细胞系的lncRNA MEG8呈过表达，抑制miRNA-34a和miRNA-203基因，导致SNAIL家族转录因子的上调，促进钙黏蛋白的表达引起EMT发生。有研究者[16]发现lncRNA与EZH2(enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit)结合，使甲基化组蛋白H3第27位赖氨酸受到抑制，从而使转录沉默抑制EMT发生；而同基因位点的MEG3调节miRNA-200家族基因调控区域上JARID2和EZH2的募集以及组蛋白H3甲基化从而抑制下游基因表达，进而抑制EMT。 Chen等[17]发现lncRNA MRPL23-AS1与EZH2结合形成RNA-蛋白质复合物来介导E-钙黏着蛋白的转录沉默使其下调，进一步促进EMT进展。Shen等[18]研究发现，LncRNA XIST在胰腺癌细胞系中高表达，并可作为ceRNA吸附miRNA-429上调ZEB1,从而介导EMT发生并促进胰腺癌的侵袭和转移。Gao等[19]报道在胰腺癌中lncRNA linc-DYNC2H1-4呈高表达，过表达linc-DYNC2H1-4使胰腺癌细胞EMT关键分子ZEB表达上调，导致靶蛋白vimentin和E-cadherin分别上调和下调，从而增强胰腺癌细胞肿瘤干性，导致胰腺癌发生侵袭和转移。Zheng等[20]发现lncRNA LOC389641在胰腺癌中表达上调后使E-钙黏着蛋白表达降低，从而增强胰腺癌侵袭转移能力。

3 lncRNA协同miRNA介导胰腺癌侵袭转移

lncRNA可作为内源竞争RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)调控miRNA的表达，进而影响胰腺癌生物学行为。lncRNA协同miRNA形成ceRNA机制参与肿瘤细胞侵袭和转移进程具有以下方式[10]。(1)lncRNA作为miRNA海绵/诱饵：lncRNA在肿瘤中与miRNA发生吸附作用，使得miRNA表达异常，从而促进下游靶标的增加；(2)lncRNA和miRNA相互抑制：如lncRNA ZEB2-AS1与miR-204相互抑制，调控下游miR-204/HMGB1轴，通过负调控发挥作用(表1)，具体机制详见图1。

LncRNA XIST[21]在胰腺癌中高表达，可作为EGFR的ceRNA与miRNA-113a结合，减弱miRNA-113a对下游靶点EGFR的抑制作用，从而提高胰腺癌细胞增殖能力。研究[22]发现lncRNA ZEB2-AS1在胰腺癌中高表达，抑制miRNA-204表达并对下游靶点HMGB1负调控作用减弱，HMGB1表达上调后促进胰腺癌细胞增殖和侵袭转移。Lei等[23]研究表明Linc00976在胰腺癌中表达明显上调，并可与 miRNA-137竞争性结合，抑制miRNA-137对OTUD7B的促降解作用，从而增加OTUD7B的表达，进一步激活下游EGFR/MAPK信号通路，进而促进胰腺癌的增殖和侵袭转移。Zhang等[24]研究发现，lncRNA PSMB8-AS1在胰腺癌中表达上调，并与细胞凋亡呈正相关，促进胰腺癌增殖、侵袭和转移；进一步实验明确了胰腺癌的PSMB8-AS1/miR-382-3p/STAT1/PD-L1调控轴，为胰腺癌的靶向治疗提供了理论依据。miRNA-343-3p在胰腺癌组织和细胞系中表达均显著降低[25]，低表达miRNA-343-3p可促进胰腺癌增殖和转移。Wang等[26]报道lcnRNA 00941在胰腺癌发病过程中发挥重要的调控作用，lcnRNA 00941可结合miRNA-335-5p，激活下游靶点ROCK1，从而活化LIMK1/Cofilin-1信号通路促进胰腺癌发生增殖、侵袭和转移。Xu等[27]研究发现lncRNA CERS6-AS1可作为ceRNA调控miRNA-217，上调YWHAG和磷酸化RAF1，进一步激活ERK通路促进胰腺癌侵袭转移。

4 lncRNA抑制胰腺癌细胞铁死亡

铁死亡是基于铁过载的脂质活性氧 (lipid reactive oxygen species, L-ROS)异常堆积而引起的一种调节性细胞死亡(regulated cell death, RDC)。目前研究[28-30]表明，铁死亡可抑制肿瘤生长，lncRNA可通过直接作用于铁死亡相关蛋白分子，或间接作用于下游靶点或通路抑制肿瘤细胞发生铁死亡，进而促进肿瘤细胞发生侵袭转移。线粒体融合蛋白(mitofusin, Mfn)是线粒体融合过程中的关键蛋白，当敲除小鼠胚胎成纤维细胞中的Mfn2后，可引起ROS产物增加，从而导致抗氧化机制过度消耗引起脂质过氧化，这提示Mfn2在铁死亡中可能发挥重要作用。有研究[30]报道miRNA-125a可通过靶向Mfn2调节胰腺癌细胞线粒体的功能及代谢水平，从而影响胰腺癌细胞的生长，这进一步揭示了miRNA可通过靶向Mfn2在肿瘤细胞铁死亡中发挥调控作用。 研究[31]发现lncRNA和miRNA等表观遗传修饰因子可调控肺癌发病过程，并通过LSH/ELAVL1/lncRNA 00336轴促进肺癌细胞增殖和侵袭转移，从而抑制肺癌细胞发生铁死亡；另外，lncRNA 00336还可与miRNA-6852直接结合，成为CBS介导铁死亡抑制的负上游调控因子，以上研究表明lncRNA 00336可抑制铁死亡，促进肺癌的增殖和转移。Hayano等[32]研究发现lncRNA 00336可促进转硫代谢途径中铁死亡替代标志物胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)的表达，进一步引起胱硫醚向半胱氨酸转化而抑制铁死亡，促进肿瘤细胞生长。但是，有关lncRNA调控肿瘤细胞铁死亡分子机制仍需进一步实验证实才能更好地指导肿瘤治疗和干预。

表1 lncRNA协同miRNA调控下游靶点介导胰腺癌侵袭转移相关研究

注：A，lncRNA XIST作为ceRNA下调miR-113a，靶向调控EGFR促进胰腺癌侵袭转移；B，lncRNA ZEB2-AS1协同miR-204相互抑制，上调HMGB1机制；C，lnc00976通过下调miR-137，使OTUD7B上调，激活下游EGFR/MAPK信号通路；D，lncRNA PSMB8-AS1通过调控miR-382-3p，使下游靶基因STAT1上调；E，lncRNA OIP5-AS1作为海绵吸附miR-342-3p，调控并激活AKT/ERK信号通路；F，lcnRNA PVT1 调控miR-619-5p 激活Pygo2和ATG14；G，lcnRNA 00941调控miR-335-5p，上调ROCK1后激活LIMK1/Cofilin-1信号通路；H，lcnRNA CERS6-AS1通过竞争性结合miR-127，上调 YWHAG并磷酸化RAF1，激活ERK信号通路。图1 lncRNA协同 miRNA调控下游靶点影响胰腺癌侵袭和转移机制

5 lncRNA与胰腺癌细胞自噬

在真核生物的生长发育中，自噬是维持细胞稳定的重要环节。在癌症发生和进展的不同阶段，lncRNA表达水平的变化与自噬的程度具有明显相关性。lncRNA通过影响自噬启动上游信号通路，或者在转录水平调节ATG的表达来调控肿瘤细胞自噬从而影响其恶性生物学行为。尽管在胰腺癌中有关lncRNA与自噬的研究较少，但已有研究[33]发现在胰腺癌组织中，lncRNA PVT1的表达水平与ULK1蛋白表达水平相关，高表达PVT1与患者生存率低相关；lncRNA PVT1通过海绵效应调节miRNA-20a-5p，靶向调控ULK1表达促进胰腺癌细胞发生自噬，进而影响其增殖和侵袭转移能力。最新研究[34]发现MALAT1与LC3B mRNA表达呈线性正相关，当下调 MALAT1可影响细胞自噬关键分子LC3、P62及LAMP-2的表达；以上研究还证实MALAT1与RNA结合蛋白 HuR可相互作用，沉默 MALAT1 可显著增强 转 录 后 调 控，并通过竞争性抑制作用调控K-ras的表达，进一步抑制自噬流，最终促进胰腺癌细胞的增殖和转移能力。

6 外泌体lncRNA与胰腺癌

外泌体是广泛存在于体液中具有纳米级双层脂质包裹体结构，它是细胞间运输载体传递生物的重要分子[35]。研究[36]表明肿瘤细胞可分泌更多的外泌体参与肿瘤的进程。lncRNA可以外泌体的形式分泌到细胞外体液而影响肿瘤侵袭转移能力。有研究[37]报道在高侵袭性胰腺癌细胞的外泌体中发现名为 Sox2ot 的 lncRNA，Sox2ot 在血浆外泌体中高表达，并与胰腺癌患者的TNM分期、淋巴结转移及总生存率相关。进一步研究证实，Sox2ot 与 miRNA-200 家族竞争性结合，反向调控 Sox2表达，维持肿瘤细胞EMT 和干细胞样特性，从而促进胰腺癌的侵袭转移；体内环境下肿瘤细胞产生的外泌体可排泄到人体血液循环中，在胰腺癌患者术后的血清中检测到外泌体Sox2ot表达量降低，该研究揭示了外泌体中的 lncRNA Sox2ot 可作为胰腺癌转移过程的重要标志物。总之，结合外泌体分子特异性，未来可开发有效和便利的基于外泌体 lncRNA生物标志物的检测手段，检测外泌体中循环肿瘤相关 lncRNA，并用于评估早期阶段的胰腺癌患者或健康人群潜在的癌症风险[38]。

7 m6A甲基化对lncRNA促癌调控作用

lncRNA不仅可通过调控EMT、miRNA、铁死亡、自噬、外泌体等多种途径影响胰腺癌侵袭和转移过程，同时，lncRNA还可被M6A调控进而影响胰腺癌的恶性生物学行为。

m6A甲基化是在哺乳动物身体中对mRNA和lncRNA修饰最多的表观方式[39-40]。m6A已被证明在各种正常生物过程如组织发育、干细胞分化、热休克等中起关键作用。m6A可通过m6A编写器(甲基转移酶如METTL14)和读取器(信号转换器)参与lncRNA对肿瘤细胞的侵袭转移过程。有研究[41]发现METTL14在胰腺癌中高表达，METTL14 通过miRNA-1-3p/Rap1B/cRAF/MEK/ERK通路促进胰腺癌的发生增殖、侵袭转移。赵炎等[42]通过研究发现m6A去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌中低表达，使APC基因高表达而抑制 Wnt 通路下游基因 TCF4 转录，进而促进胰腺癌细胞增殖和侵袭转移。总之，m6A作为最多见的RNA修饰方法参与RNA代谢过程(包括加工，出核和翻译等)而增强肿瘤细胞的恶性生物学行为，这将为利用m6A甲基化修饰辅助治疗恶性肿瘤提供了新的方向[43-44]。

8 小结和展望

lncRNA 可从多个方面调控肿瘤细胞的生物学行为，与胰腺癌EMT及侵袭转移密切相关。lncRNA-miRNA协同的ceRNA机制网络影响胰腺癌发病过程中的许多重要环节。随着基因芯片和高通量测序技术的发展，新型 lncRNA 分子的发现可为胰腺癌的早期诊断提供新思路和方向。尽管目前关于非编码RNA与肿瘤相关研究较多，与其相关的部分信号通路已被发现，但很多具体的肿瘤发病分子机制仍不完全明确，还未寻找到特定 lncRNA 的疗法用于克服肿瘤细胞的耐药(其中包括胰腺癌)。未来将继续深入研究胰腺癌发病过程中的早期分子诊断标志物及靶点，争取为胰腺癌的预防和治疗提供新的视角和理论依据。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：徐建负责课题设计，资料分析，撰写论文；徐建、潘燕妮和刘欣原参与收集数据，修改论文；江建新负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。