1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清国家参考品的制备

陈琼，王珊珊，石继春，王春娥，李红，李茂光，叶强

中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050

肺炎球菌为一种条件致病菌，是侵袭性肺炎球菌疾病和社区获得性肺炎的主要病原菌，也是脑膜炎、菌血症、急性中耳炎和鼻窦炎的常见病原菌，老人和儿童是肺炎球菌感染的高危人群［1-2］。2015年，全球约有583万5岁以下儿童死亡，其中29.4万是由肺炎球菌感染引起的［3］。无论在发达国家还是在发展中国家，肺炎均是导致老年人死亡的主要原因之一［4-5］。由于肺炎球菌的耐药性问题日趋严重，通过疫苗接种来预防肺炎球菌感染显得尤为重要［6-7］。

肺炎球菌细胞壁外层荚膜多糖是其主要毒力因子，具有型特异性，根据其荚膜多糖结构不同，目前已发现90多个血清型［8-9］。荚膜多糖作为23价肺炎球菌多糖疫苗和13价肺炎球菌多糖结合疫苗的活性成分，多糖含量测定是疫苗效力试验的替代指标，也是确保肺炎球菌结合疫苗质量有效稳定的重要质控指标之一。目前，《中国药典》三部（2020版）中规定，采用速率比浊法检测各型多糖含量［10］，因此建立稳定、无交叉反应的肺炎球菌特异性血清国家参考品是控制肺炎球菌疫苗质量的关键因素。本实验通过速率比浊法确定1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清候选参考品的工作浓度、线性范围、检测限、定量限、专属性和稳定性，制备国家参考品。

1 材料与方法

1.1血清及多糖 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清候选参考品（编号分别为：PSS-2018-1、PSS-2018-3、PSS-2018-4、PSS-2018-5、PSS-2018-6B、PSS-2018-7F、PSS-2018-9V、PSS-2018-14、PSS-2018-18C、PSS-2018-19A、PSS-2018-19F和PSS-2018-23F）由兰州生物制品研究所有限责任公司提供，分装体积为1 mL／支，-70℃保存；1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎球菌多糖（批号分别为：1T-BZ20180901、3T-BZ20190101、4T-BZ20180901、5T-BZ20180901、6BT-BZ20180901、7FT-BZ20180901、9VT-BZ20180901、14T-BZ20181001、18CT-BZ20181101、19AT-BZ20181101、19FT-BZ20181101和23FT-BZ2018-0901）由成都生物制品研究所有限责任公司提供，500μg／mL，-70℃保存；1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型肺炎球菌特异性血清（批号分别为：K112M2、M321M1、G411M1、L511M3、B617M1、M712M1、N9d41M1、G1413M2、H1812M2、K19c11M2、L19b21M2和D23b11M2）购自丹麦血清研究所；23价肺炎球菌多糖疫苗由厂家1（批号：20190411、20190412和2019-0413）和厂家2（批号：S003762、S004498和S004574）提供。

1.2主要试剂及仪器 UDR试剂盒、IMMAGE BUF1、IMMAGEDIL1、IMMAGEWashing Solution及双光径速率浊度免疫分析系统（IMMAGE 800 Immunochemistry System）均购自美国Beckman公司。

1.3检测方法 选择双光径速率浊度免疫分析系统的非竞争性浊度模式进行检测，多糖体积为21μL，间隔A（血清）体积为21μL，间隔B体积为0，反应缓冲液300μL，增益系数为4，反应时间为3.5 min，反应杯温度为37℃。

1.4候选参考品血清工作浓度和线性范围的确定12种兔源血清候选参考品用IMMAGE DIL1进行0（原倍）、2、3、4倍稀释，相应型别肺炎球菌多糖均用IMMAGE DIL1稀释至0.5、1、2、3、4、6、8、10和20μg／mL，采用非竞争性浊度模式下的Rate Mode模式进行检测，平行测定2次。以多糖浓度为x，响应值为y建立线性回归方程，计算相关系数（R2），确定血清工作浓度和线性范围。

1.5候选参考品检测限及定量限的确定 以IMMAGE DIL1作为空白对照溶液，采用1.3项方法进行检测，连续检测10次，计算反应值的平均值（x）和标准偏差（SD），确定检测限及定量限。

1.6候选参考品专属性的检测 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎球菌多糖根据血清型别配制相应的阴性对照，即除相应的型别外，将其他22种多糖用IMMAGE DIL1混合，配制成浓度为4.0μg／（mL·型）的多糖混合液；以1.0μg／mL相应型别多糖作为阳性对照。取阴性对照和阳性对照，采用工作稀释浓度的候选参考品，按1.3项方法进行检测。

1.7候选参考品稳定性的检测 将12型血清候选参考品按1.4项方法稀释后，于2~8℃放置0和28 d；相应型别的多糖用IMMAGE DIL1稀释为1、2、3和4μg／mL。按1.3项方法检测，并计算血清候选参考品放置28 d后的相对标准偏差（RSD）。

1.8与市售血清检测结果比较 采用候选参考品（血清1）和市售丹麦血清（血清2）与对应型别的肺炎球菌多糖（1、2、3和4μg／mL）确定标准曲线，测定分别由厂家1和厂家2提供的各3批23价肺炎球菌多糖疫苗，并计算RSD。

2 结果

2.1候选参考品的工作浓度和多糖线性范围 根据候选参考品原倍及2、3和4倍稀释液与多糖的反应值，确定了各型候选参考品工作浓度（稀释倍数）；各型候选参考品在相应工作浓度下，多糖浓度在1~6μg／mL范围时，与响应值呈良好的线性关系，相关系数（R2）均>0.980。见表1。

表1 候选参考品的工作浓度和线性范围Tab.1 Workingdilutionsand linear rangesof candidatereferences

2.2候选参考品的检测限及定量限 各型候选参考品检测限为0.673~5.370，定量限为2.24~17.90，见表2。两者均低于多糖候选参考品最低点（1μg／mL）时的反应值，表明标准曲线的最低点高于定量限。

表2 检测限及定量限检测结果Tab.2 Determination of limits of detection and quantitation

2.3候选参考品的专属性 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清候选参考品的阴性对照检测值分别为1.723、2.087、1.464、0.923、1.257、0.908、1.707、1.511、0.762、0.837、1.357、1.232，均低于定量限；阳性对照检测值分别为18.87、27.86、11.83、15.04、9.70、10.64、7.42、8.94、15.77、6.90、13.14、9.96。表明候选参考品与其他型别的多糖抗原无交叉反应，特异性良好。

2.4候选参考品的稳定性 12种候选参考品于2~8℃放置28 d后与放置0 d时比较，反应值的RSD均<10%，见表3。表明候选参考品于2~8℃放置28 d的稳定性良好。

表3 候选参考品稳定性的检测结果Tab.3 Stability test results of candidate references

2.5与市售血清检测结果比较 血清1和血清2对厂家2生产的3批23价肺炎球菌多糖疫苗（批号：S003762、S004498和S004574）中6B和9V型多糖检测结果的RSD均>15%，对厂家2疫苗中其他型别及厂家1疫苗（批号：20190411、20190412和20190413）所有型别多糖检测结果的RSD均<15%，见表4。

表4 2种血清检测不同厂家23价肺炎球菌多糖疫苗中各型多糖含量的结果Tab.4 Determination results of polysaccharide contents of various serotypes in 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccines from various manufacturers by prepared national references and commercial serum

3 讨论

1983年，23价肺炎球菌荚膜多糖疫苗在美国获批上市［11］；2000年，7价肺炎球菌多糖结合疫苗在美国获批上市［12］；2010年，13价肺炎球菌多糖结合疫苗替代7价肺炎球菌多糖结合疫苗上市［13］。肺炎球菌多糖作为肺炎球菌多糖疫苗的主要活性成分，各型多糖含量的测定是该疫苗效力试验的替代指标，是确保该疫苗质量有效稳定的重要质控指标之一。1983年，LEE［14］建立了用于检测23价肺炎球菌多糖疫苗中的各型多糖含量的光散射定量比浊法。本课题组前期将该方法转移至实验室，进行了相关的方法学验证，在肺炎球菌多糖国家参考品的研制中，采用该方法进行了多糖定量的协作标定，建立了肺炎球菌多糖国家参考品［15］。目前，全球仅有丹麦血清研究所提供肺炎球菌型特异性血清，但价格昂贵、货期长，且不同批号之间抗体含量不稳定，因此，亟需制备稳定、无交叉反应的肺炎球菌特异性血清国家参考品，用于速率比浊法检测各型多糖含量。

本实验采用免疫化学系统（IMMAGE 800），选择特定参数，12种血清候选参考品的工作浓度在原倍至4倍稀释之间，对应型多糖浓度在1~6μg／mL检测范围内，与反应值呈良好的线性关系（R2＞0.980）；各型血清候选参考品检测限和定量限均低于多糖参考品最低点（1μg／mL）；专属性检测结果显示，阴性对照均低于定量限，表明12种特异性血清候选参考品特异性好，无交叉反应；工作浓度血清于2~8℃保存28 d仍具有良好的稳定性；市售血清及本实验制备的血清国家参考品对厂家2生产的3批制品中6B和9V型检测结果的RSD>15%，可能是由于6B和9V均是因子血清，比型特异性血清抗原位点少，多糖来源不同，导致结果有较大差异；对厂家2其他型别及厂家1所有型别检测结果的RSD均<15%。对于厂家2生产的23价肺炎球菌多糖疫苗，6B型和9V型血清结果需进行进一步验证。

本实验制备的1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清国家参考品具有良好的特异性和稳定性，可用于速率比浊法检测肺炎球菌多糖疫苗和多糖结合疫苗中的多糖含量。