Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度对照品的建立

黄翟，赵王丽，宋天扬，罗正辉，杨东琼，葛绕玲，雷银瓶，范金，易力，3

1.中国医学科学院医学生物学研究所，云南昆明650000；

2.昆明市疾病预防控制中心，云南 昆明650228；

3.国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量控制与评价重点实验室，四川成都611731

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗是2015年由国家食品药品监督管理总局批准上市的国家一类创新疫苗［1］，该疫苗主要用于儿童预防脊髓灰质炎病毒感［2-5］。在Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗生产过程中，病毒经接种、培养、收获后获得病毒收获液，经过滤澄清超滤浓缩至一定倍数后，再经凝胶过滤层析和离子交换层析纯化获得病毒纯化液［6-7］。病毒纯化液纯度是质量控制的重要指标之一，通过使用高效液相色谱仪搭配凝胶色谱柱进行纯度检定，根据峰高、峰面积、保留时间数据并结合峰型情况进行结果判定。

在对病毒纯化液进行纯度检定的过程中，凝胶色谱柱多次上样后会出现色谱柱填料塌陷、色谱柱堵塞等问题，造成色谱柱分离性能下降，出现肩缝、前沿峰、峰拖尾、峰低等异常峰型；另外样品异常或色谱系统漏液、柱压波动、检测器异常（污染、灯能量降低等）等，也会导致峰型异常、峰低、保留时间漂移等［8-14］。当检测结果出现异常时，使用对照品上样，通过对结果分析，可快速确定异常是由样品还是色谱柱引起。但由于Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液中的病毒由相对分子质量为25 000~38 000的C抗原和D抗原组成［15-16］，市面上没有相同规格的商售对照品，当检测结果出现异常时，仅能通过更换色谱柱、检查色谱系统无异常后重新上样等操作才能找到原因，对检定的及时性造成一定影响。

本研究对Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液进行超滤浓缩，得到对照品，并在不同温度下进行保存，定期检测纯度，通过对峰高、峰面积、峰型、保留时间的分析，确定合适的保存温度和时间，为Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度对照品的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1病毒 Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒（Ⅲ型）纯化液由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

1.2主要试剂及仪器 磷酸氢二钾（AR）、磷酸二氢钾（AR）、氯化钠（AR）购自西陇科学股份有限公司；色谱柱［Waters ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）工作柱、Waters ultrahydrogel（6 mm×40 mm）保护柱］、高效液相色谱仪（1525-PDA2998）购自美国Waters公司。

1.3病毒纯化液浓缩 取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液于超滤离心管中，1 509×g离心10 min，收集离心管滤芯上剩余溶液混匀，最终浓缩倍数为10倍，取1 mL进行纯度检测。剩余样品分装至24个液相瓶中，1 mL／瓶。各取12瓶分别置4、-20℃条件下保存。分别对4、-20℃条件下保存0、3、6、9、12个月样品进行纯度检测。

1.4纯度检测 流动相为0.1 mol／mL磷酸盐-0.1 mol／mL氯化钠缓冲液；流速为0.3 mL／min；检测器为二极管阵列检测器（PDA）；检测波长为280 nm；色谱柱为Watersultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）工作柱和Watersultrahydrogel（6 mm×40 mm）保护柱；柱温为室温；上样量为100μL；采集时间为40 min。工作站软件积分参数为默认，不调整积分参数，分别记录各样品峰高、峰面积、保留时间。

2 结果

2.1峰高变化4℃条件下保存12个月内（含12个月），目标峰均能被检出，峰高未见明显下降，在0.071~0.081 7 Au之间；保存12个月后峰高（0.072 4 Au）较0个月（0.081 7 Au）降低了11.4%，降幅较小。在-20℃条件下保存12个月内（含12个月），峰高随保存时间延长而降低，保存12个月后峰高降低了44.3%（从0.081 7 Au下降至0.045 5 Au），降幅较大，但目标峰仍能被检出。见图1。

图1 4和-20℃条件下保存12个月对照品中目标峰的峰高变化Fig.1 Change of height of target peak of reference substance during storage at 4 and-20℃for 12 months

由以上数据可以看出，对照品在4和-20℃保存12个月，目标峰均能被检出。表明Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液进行超滤浓缩后获得的对照品，在4和-20℃条件下放置12个月均能保持稳定，4℃时峰高波动较-20℃时小。

2.2峰面积变化 4、-20℃保存条件下，对照品中目标峰峰型基本保持一致，-20℃目标峰前的基线抬起较4℃明显，但不影响对目标峰结果的判定，峰面积百分比均为100%。见图2。

图2 4和-20℃条件下分别保存3、6、9、12个月对照品色谱图Fig.2 Chromatograms of reference substance stored at 4 and-20℃for 3，6，9 and 12 months

4℃条件下保存12个月内（含12个月），目标峰均能被检出，峰面积随保存时间延长整体呈降低趋势，最低峰面积为保存12个月后（3 506 553 Au*s），较0个月（3 842 627 Au*s）仅降低8.8%，降幅较小。在-20℃条件下保存12个月内（含12个月），峰面积随保存时间的延长整体呈降低趋势，最低峰面积为保存12个月后（2 468 449 Au*s），较0个月（3 842 627 Au*s）降低35.8%，降幅较大，但目标峰仍能被检出。见图3。

图3 4和-20℃条件下保存12个月对照品中目标峰峰面积变化Fig.3 Change of area of target peak of reference substance during storage at 4 and-20℃for 12 months

由以上数据可以看出，对照品在4和-20℃保存12个月，目标峰均能被检出，各样品中目标峰峰型基本保持一致，峰面积百分比均为100%。表明Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液进行超滤浓缩后获得的对照品，在4和-20℃条件下保存

12个月均能保持稳定，4℃时峰面积波动较-20℃时小。

2.3保留时间变化 对照品中目标峰均能被检出，目标峰保留时间在20.714~21.06 min之间，RSD为0.69%，见图4。表明Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液进行超滤浓缩后获得的对照品，在4和-20℃条件下保存12个月均能保持稳定，目标峰保留时间具有良好的重复性。

图4 4和-20℃条件下保存12个月对照品中目标峰的保留时间变化Fig.4 Change of retention timeof target peak of reference substance during storage at 4 and-20℃for 12 months

3 讨论

本研究将Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液进行超滤浓缩后得到的对照品保存于4和-20℃条件下，并定期使用高效液相色谱法检测纯度。结果显示，在4和-20℃条件下保存12个月内，目标峰均能被检出（峰面积百分比均为100%），保留时间具有良好的重复性，-20℃时的峰高和峰面积呈下降趋势，4℃时的峰高和峰面积变化较小，且4℃时的峰高、峰面积波动小于-20℃时的峰高、峰面积波动，4℃时的峰型优于-20℃时的峰型。Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度对照品在4和-20℃条件保存12个月内均保持稳定可正常使用。综合结果分析和考虑实验中操作的便利性，选择4℃作为纯度对照品的保存条件。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度对照品的建立，为使用高效液相色谱法进行纯度检定过程中出现异常结果时提供了可用的对照品，使用该对照品上样，可快速确认异常结果是由样品还是色谱柱异常造成的。Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗作为国家一类疫苗，用于儿童脊髓灰质炎病毒的预防，其质量关乎每个儿童的健康。病毒纯化液的纯度检定是其重要的质量控制指标之一，纯度对照品的建立解决了商售对照品的缺乏对纯度检定异常结果分析带来的困难，对于保障Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗的质量具有重要意义。

本研究尚存在不足之处，首先，本研究为前期探索试验，未对蛋白含量进行检测；其次，参考大部分对照品及标准品有效期为1年的要求，目前仅完成1年的检测，期间纯度峰的峰高、峰面积、保留时间虽然有一定变化，但在不同保存条件下保存1年后，纯度峰均能自动积分，峰高（最低为0.045 5 Au）较高，峰面积（最低为2 468 449 Au*s）较大，保留时间波动（RSD为0.69%）较小，因此未能给出峰高、峰面积和保留时间的可接受标准。未来的工作中，我们将会关注Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液浓缩前后及不同保存条件下蛋白含量的变化，并持续观察Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度对照品纯度峰的峰高、峰面积、保留时间的变化，直至不能检测到纯度峰为止，从而确定峰高、峰面积、保留时间的可接受标准，同时也对对照品的保存时长进行持续研究。