泛素蛋白酶体系统调控非酒精性脂肪性肝病研究进展

高星星，刘永刚，刘亚珠，李京涛，曾立伟，闫曙光，魏海梁，常占杰

【提要】 泛素蛋白酶体系统是一种重要的蛋白质降解系统，参与多种蛋白质相关通路的调节。多项研究发现，泛素蛋白酶体系统与非酒精性脂肪性肝病有着密切的联系，其通过参与脂质代谢、线粒体氧化功能障碍和内质网应激障碍以及相关通路进而在非酒精性脂肪性肝病的病理进展中发挥着重要作用。本文就泛素蛋白酶体调控非酒精性脂肪性肝病进行综述。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是我国第一大慢性肝病，最近的meta分析显示，中国NAFLD的发病率达到了29.2%。NAFLD是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和遗传易感因素密切相关的代谢应激性肝损伤[1]，其病理进展包括脂肪变性、脂肪毒性和炎症三联反应的过程，当前研究发现，脂肪变性、氧化应激和TNF-α、IL-6等炎症介质的存在与NAFLD中CAR、PXR、PPAR-α等核因子的改变有关[2]。全球流行病学显示，NAFLD可进展为肝硬化(cirrhosis of liver,LC)甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[3]。越来越多的实验与临床证据表明，泛素蛋白酶体(ubiquitin-proteasome system，UPS)及其相关通路与NAFLD密切相关，而泛素化中间丝体包涵体和Mallory体相关蛋白可作为评估NAFLD患者的可靠生物标志物[4]，且泛素也是非酒精性肝纤维化的标志[5]。本文综述了泛素化及去泛素化的过程和功能，并总结了近年来UPS调控NAFLD治疗靶点的研究现状。

1 泛素蛋白酶体

泛素蛋白酶体是一种蛋白质降解系统，包括泛素化酶(ubiquitinating enzymes ubs)、26S蛋白酶体(26S proteasome)以及去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，dubs)[6]。近年来的研究发现，泛素蛋白酶体系统的异常直接或间接地参与了癌症、炎症和神经退行性疾病等疾病的发病机制[7]。

1.1 泛素化

由泛素化酶E1泛素激活酶(ubiquitin-activatingenzyme)、E2 泛素结合酶(ubiquitin-conjugatingenzymes)、E3 泛 素 连 接 酶(ubiquitin-ligaseenzymes)依次激活、结合并连接泛素C末端的甘氨酸(Gly)残基共价结合到底物蛋白的过程称为泛素化。泛素化过程需要ATP的参与，E1的半胱氨酸(Cys)残基与泛素C端Gly残基形成硫酯键，从而激活游离泛素分子；被激活的泛素与E2酶活性部位的Cys残基形成硫酯键，并转移到E2酶上；在E3酶的作用下，泛素的Gly残基和底物蛋白的Lys残基形成异肽键并转移到底物蛋白上，最终形成泛素化底物。在少数情况下，靶蛋白的N端也可被泛素化[8]。根据靶蛋白修饰的作用形式不同，泛素化可分为单泛素化、多泛素化和多聚泛素化[9]。

1.2 去泛素化

蛋白质泛素化是动态翻译后修饰(protein translational modifications,PTMs)最有效的修饰之一[10]。Dubs通过从底物中去除泛素或在泛素链中切割泛素从而去除泛素信号，进而调节泛素化的过程称为去泛素化[11]。因此，泛素化是一个可逆的过程。研究发现，dubs包括7个家族：泛素特异性蛋白酶(USPs)、JAB1/MPN/Mov34金属酶(JAMM)、卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs)、Josephin and JAB1/MPN+(MJP)、泛素C端水解酶(UCHs)、含miu的新型DUB(MINDY)和含锌指的泛素肽酶1(ZUP1)[7]。

2 泛素蛋白酶体系统与NAFLD

泛素蛋白酶体在蛋白酶体降解、选择性自噬以及及细胞程序性死亡等过程中均有参与[12]。近年来，多项研究证实UPS通过参与脂质代谢、线粒体氧化功能障碍和胰岛素抵抗等方面影响NAFLD的发生发展。

图1 NAFLD发病机制示意图

2.1 脂质代谢

2.1.1 从头脂肪生成

从头脂肪生成(de Novo lipogenesis，DNL)是肝脏调节脂质代谢的四种途径之一，临床数据表明，DNL的调节异常是NAFLD患者肝脏脂质积累的主要特征。

在肝脏脂质代谢中，DNL使肝脏能够从乙酰辅酶A中合成新的脂肪酸。因此，DNL升高可引起肝脂肪变性，甚至可能导致脂肪性肝炎。固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP1c)是协调DNL转录调控的两个关键转录因子之一，它激活肝脏中几乎所有与甘油三酯和脂肪酸合成相关的基因。同时，SREBP1c控制FASN、ACACA等DNL途径中关键合成酶的转录，在NAFLD的进展中发挥关键作用[13]。Fbw7a是SREBP1c的主要E3连接酶，相关研究表明，Smad泛素化调节因子1(smad ubiquitination regulatory factor 1,Smurf1)具有增强SREBP-1c的稳定性进而激活脂质合成的作用。同时，Smurf1在NAFLD中具有E3连接酶独立催化活性的特点。Smurf1通过与Fbw7a竞争性地相互作用于SREBP1c的同一个区域，保护SREBP1c不被泛素化和降解，维持了SREBP1c的稳定性。此外，mTORC2还能诱导依赖fbw7a的SREBP-1c降解，并抑制癌细胞中的脂肪生成，减轻肝癌的进展[14]。

泛素特异性肽酶7(ubiquitin specific peptidase 7,USP7)是一种在以前研究中被证明具有抗癌作用的去泛素化酶。最新研究发现，USP7在DNL中亦具有重要的作用，锌指蛋白638(zinc finger protein 638,ZNF638)是最大的转录因子家族的成员之一。TRAF的结构域通过介导USP7去泛素化ZNF638中的赖氨酸48连接的多泛素链以及稳定cAMP反应性元素结合蛋白(CREB)的转录活化来控制肝细胞中ZNF638的蛋白质水平。USP7/ZNF638轴调节ACACA、FASN和SCD酶介导的肝脏DNL途径，USP7/ZNF638轴通过AKT/mTORC1/S6K信号传导选择性地提高了裂解的SREBP1c在细胞核中的积累，并形成了USP7/ZNF638/SREBP1C核复合物来激活FASN等脂质发生酶促进DNL，但不影响SREBP1C全长蛋白[15]。

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是DNL途径的重要参与者。研究发现，SNX8(sorting nexin 8，SNX8)是FASN介导的NAFLD进展的潜在抑制因子，其显著降低了脂肪酸合成和炎症反应相关基因的mRNA表达。SNX8通过招募TRIM28(一种E3连接酶)进行K48连接多聚泛素化，同时增强TRIM28与FASN相互作用，诱导FASN蛋白酶体降解[16]。AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)是肝脏代谢稳态的重要能量传感器，包含有多种异源三聚体复合物，在NAFLD进展中参与调控肝脏脂肪变性与肝脏炎症。AMPK的活化可抑制DNL途径，并且可减少脂肪组织中游离脂肪酸的释放，从而防止肝脂肪变性。此外，AMPK可以通过抑制NLRP3炎症小体的激活防止肝脏炎症[17]。Makorin无名指蛋白1(makorin ring finger protein 1,MKRN1)是肝脏和脂肪细胞组织中AMPK的E3泛素连接酶。最近研究表明，尽管AMPK具有慢性激活和独立作用复杂性的特点，但MKRN1的抑制足以长期激活肝脏和脂肪组织中的AMPK，进而抑制肝脏脂质积累和炎症的发生[18]。

2.1.2 脂肪酸氧化

脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)亦是肝脏调节脂质代谢的四种途径之一，其过程中产生大量的活性氧(ROS)、氧化应激和有毒的二羧酸可能会促进炎症和疾病进展[13]。Nrf2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是细胞抗氧化应激的主要调节因子，主要负责诱导解毒和抗氧化酶的表达。Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是调节Nrf2活性的E3泛素连接酶[19]。Nrf2的活性受Keap1的严格调控，在生理条件下，Nrf2通过与Keap1的相互作用被蛋白酶体降解形成复合体。当细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2从复合体中解离并转位到细胞核中，与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，从而启动抗氧化反应。KEAP1-NRF2-ARE轴是一种重要的毒性途径，如果其受到干扰，会产生不良的健康问题。[20]嘌呤霉素敏感性氨肽酶 (puromycin-sensitive aminopeptidase, PSA)是肝脏脂质代谢的关键调节因子，负责催化多肽n端附近氨基酸的裂解，同时参与脂肪生成和脂肪酸b氧化。有研究发现，PSA通过抑制Nrf2的泛素化，进而激活Nrf2和下游的抗氧化酶来减轻氧化应激并减轻脂肪变性[21]。

2.2 炎症反应

肝脏中的炎症反应促进了NASH的发展以及随后肝纤维化、肝硬化、肝癌的进展。在NAFLD中，炎症的触发可能来自肝脏外(如肠道)或者器官内(如细胞死亡途径)。随着炎症活动的持续，导致肝脏中发生慢性炎症变化，使处于亚致死脂肪毒性损伤状态的肝细胞进一步损伤，从而加剧肝脏组织损伤，并可能出现异常的伤口愈合反应，促进NASH和肝纤维化的发展[22]。

JNK和NF-κB是参与NAFLD慢性炎症发展的主要炎症通路。JNK是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员之一，与细胞凋亡的激活和NASH的发展有关。NF-κB是炎症激活的主要调节因子，其中的IKK2亚基是其在急性炎症反应中激活所需的主要成分[23]。TNF-α诱导蛋白3(TNF alpha induced protein 3,TNFAIP3)是一种泛素编辑酶，其通过干扰NF-κB信号蛋白的泛素化以及去泛素化来抑制NF-κB信号级联反应[24]。TNFAIP3相互作用蛋白3(TNFAIP3 interacting protein 3,TNIP3)在NASH进展中是TAK1激活的新抑制因子。研究表明，TNIP3通过其AHD1结构域与TAK1结合，阻止其被E3连接酶TRIM8泛素化，进而抑制了TAK1的激活及其下游的IKKb-NF-ΚB和MKK7-JNK信号级联的激活，从而减轻NASH的肝损害。同时，TNIP3的去泛素化完全独立于与TNFAIP3相关的去泛素化。同时，在NASH环境下，TNIP3的AHD1结构域决定其与TAK1的相互作用以及其下游的MKK7-JNK和NF-ΚB信号的激活。因此，TNIP3的AHD1结构域可能是消除代谢应激诱导的炎症和代谢失调的精确靶点，且不会损害肝细胞抵抗宿主内入侵病原体的能力[25]。此外，肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TNF receptor associated factor 6,TRAF6)在因TGF-β激活TAK1介导的IKK、JNK和p38通路中至关重要，TAK1上的K158可被TRAF6泛素化[26]，TAK1-K158是受TNIP3表达影响的特异性泛素化位点。该研究认为，这一发现丰富了TNIP3作为炎症反应和代谢失调反应中TAK1激活抑制剂的功能，这在未来可能作为一种新的替代治疗策略来调节NASH过程中的TAK1过度激活[25]。

ASK1通路在NAFLD和纤维化的发展中起着至关重要的作用。ASK1被ROS、TNF-α、内质网应激等应激源激活，进而诱导下游p38MAPK和JNK信号通路的激活，参与调节脂滴自噬、细胞凋亡及炎症[27]。泛素醛结合蛋白1(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 1, OTUB1)是细胞中最丰富的dub之一，它能结合E2酶并且通过调节E2泛素结合物使其作为抑制剂参与各种泛素化过程[10]。OTUB1在机体内调控多种代谢相关信号分子，如MAPK、mTORC1、FOXM1和p53、和AKT等。实验研究表明，ASK1是OTUB1的关键候选靶点，其既可以直接切割靶蛋白中泛的素链，又可以通过阻断特定泛素偶联酶的功能来间接抑制泛素化。肝细胞中的TRAF6通过促进ASK1的赖氨酸6连接的多聚泛素化，加重肝纤维化和炎症。在NASH的进展中，OTUB1通过直接与TRAF6结合，抑制其赖氨酸63连接的多聚泛素化，从而抑制ASK1及其下游ASK1- JNK/p38通路的磷酸化，进一步抑制下游TRAF6-ASK1信号级联[28]。

表1 泛素蛋白酶体系统调控NAFLD机制

2.3 内质网应激障碍

内质网是分泌蛋白质和脂质代谢的主要细胞器，其对游离脂肪酸的损伤很敏感，导致未折叠或错误折叠的蛋白质的积累，从而激活了未折叠蛋白的反应，如果未折叠蛋白反应失败，应激传感蛋白如肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)会触发自噬通路，IRE1剪接并激活转录因子XBP1，XBP1通过激活JNK、NF-ΚB信号通路和产生ROS参与各种炎症级联反应。此外，UPR主要通过激活泛素化相关基因和自噬相关基因来调控UPS和自噬[29]。

越来越多的研究发现，UPS在内质网应激过程中发挥着重要的作用，一些E3连接酶通过泛素化内质网应激相关蛋白进而间接调控内质网应激过程[8]。HMG-CoA还原酶降解蛋白1(the HMG-CoA reductase degradation protein 1, Hrd1)是内质网应激通路中的一种E3连接酶，通过调节酵母中限速酶HMGCR的周转来控制胆固醇的产生。细胞内蛋白质翻译后的一个重要修饰是内质网相关降解(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)，Hrd1在ERAD中发挥关键作用，并保护细胞免受内质网应激引起的细胞死亡。此前研究表明，Hrd1还被证明催化内质网应激传感器IRE1α的泛素偶联，以抑制细胞凋亡和控制肠道干细胞的稳态。Hrd1的调控功能是通过泛素化介导的蛋白降解来实现的，Hrd1可通过多种分子机制发挥代谢调节作用，其介导的ENTPD5泛素化降解可能是肝脏代谢调控的关键途径。该研究认为，由于Hrd1的组织和器官特异性功能在很大程度上还未得到研究。因此， Hrd1的抑制剂治疗NAFLD的可行性尚需进一步研究[30]。最新关于Hrd1的实验研究表明，Hrd1作为肝脏中柠檬酸裂解酶 (ATP citrate lyase，Acly)和脂质合成的新型负调控因子，对NAFLD的改善具有重要的作用。Acly是脂肪再生的关键酶，在依赖葡萄糖的从头脂肪生成过程中发挥了关键作用，其裂解柠檬酸生成乙酰辅酶a，该过程是线粒体外脂质合成的基础。Hrd1作用于Acly的泛素化并降解Acly，从而降低其蛋白水平，致使乙酰辅酶a水平的降低和肝细胞脂质合成受到抑制，减轻脂肪变性。此外，在胰岛素抵抗环境中，Hrd1通过介导Acly降解来抑制脂质代谢中新生脂质合成和甘油三酯积累，同时改善胰岛素抵抗与脂质诱导的细胞损伤[31]。

3 结语与展望

泛素蛋白酶体途径作为细胞内主要的蛋白质水解途径之一，参与NAFLD发生发展的不同途径及过程。不同的泛素化和去泛素化酶作用于不同的靶点及通路，起着不同的调控作用。NAFLD涉及脂质代谢、自噬、氧化应激等多个方面，尽管泛素蛋白酶体系统相关靶点逐渐被关注，但由于泛素蛋白酶体系统的多样性、复杂性以及NAFLD发病机制的复杂性，泛素蛋白酶体系统相关靶点待进一步研究，为未来的NAFLD特效药物的开发提供思路。