畜禽粪污中7种磺胺类和8种氟喹诺酮类兽药残留UPLC-MS/MS检测方法研究

宋艳红，李燕秀，冯俊吾*，武晋孝，赵平伟，张 薇，米彦飞，郭 禹，马晋东

(1.山西省检验检测中心，太原 030027；2.山西农业大学，山西太谷 030801)

磺胺类和氟喹诺酮类广谱抗菌药作为畜牧业投入品，被广泛应用于畜禽养殖生产中，除治疗外，还可预防、促生长，提升动物源食品产量和质量[1]。然因此类兽药在畜禽体内不能被完全吸收、代谢和降解，大部分残留药物及代谢物会随着畜禽粪污排出体外，进入自然环境中，这些同样具有生物活性[2]的残留药物及代谢产物，会对环境、动植物和人体造成直接或者间接的危害。随着养殖业规模化、集约化飞速发展，我国畜禽粪污量同比大幅增加。据统计，目前我国年产畜禽粪污已达40亿吨[3]，畜禽粪污中兽药残留污染问题已经成为一个不容忽视的问题。因此，为了更好地掌握畜禽粪污中残留兽药的现状，有必要建立一种方便、高效、准确的畜禽粪污多兽药残留检测方法。目前，兽药残留检测方法通常有液相色谱法、微生物法、电化学检测、免疫分析法、高效液相色谱-质谱法、生物芯片法等[4]。与其他检测方法相比，超高效液相色谱-质谱进行检测具有较高的特异性和灵敏度，抗干扰能力强，定量分析及定性分析更为准确[5-7]。因此，本文拟利用固相萃取及超高效液相色谱-串联质谱技术，建立同时测定猪、鸡、牛、羊粪污中7种磺胺及8种氟喹诺酮类常用兽药的分析方法，为畜禽养殖场实时监测兽药使用情况提供技术支撑，对解决我国畜禽粪污中兽药残留污染问题具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 超高效液相色谱-串联质谱仪：UPLC TQ-S，美国Waters公司；电子天平：TP-1102，1100～0.01 g，丹佛仪器有限公司；电子天平：BP211D，210～0.01 mg，北京赛多利斯天平有限公司；高速冷冻离心机：Biofuge stratos，德国郝黎氏公司；氮吹仪：N-EVAP，美国Organomation Associates公司；涡旋震荡器：MS-3，德国IKA公司；固相萃取装置：SPE-24，美国Supelco公司。

1.2 试药与试剂 磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺喹噁啉(SQ)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)(美国Dr.E公司，纯度分别为99.2%、99.5%、99.4%、99.7%、94.2%、98.9%、99.4%)；环丙沙星(Cipro.)、达氟沙星(Dano.)、恩诺沙星(Enro.)、沙拉沙星(Sara.)(美国Dr.E公司，纯度分别为92.3%、94.2%、99.9%、85.82%)；诺氟沙星(Nor.)、培氟沙星(Pe.)、洛美沙星(Lome.)、氧氟沙星(O.)(中国兽医药品监察所，纯度分别为99.4%、99.6%、98.6%、99.5%)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氨水，色谱纯；其余均为分析纯；高纯氮；高纯氩；试验用水均为一级水；固相萃取柱：Oasis HLB(3cc/60 mg)，美国Waters公司。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18(1.7 μm，2.1×100 mm)；流动相：A 为 0.1%的甲酸水，B 为 0.1%的甲酸乙腈。采用梯度洗脱，柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL，梯度洗脱方法见表1。

表1 梯度洗脱表Tab 1 Gradient elution table

1.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；电离电压：2.7 kV；源温：150 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；锥孔气流量：150 L/h；碰撞气流量：0.15 mL/min；15种兽药的定性/定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。

表2 15种兽药的质谱参数Tab 2 Mass spectrometric parameters of 15 veterinary drugs

1.4 样品制备

1.4.1 标准溶液的制备

1.4.1.1 单标储备液的配制 分别精密称取适量的各标准物质共计15种，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇超声使其溶解，放至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成1 mg/mL的单标储备液。

1.4.1.2 混合标准储备液的配制 精密吸取上述15种1 mg/mL的单标储备液，各0.1 mL，置同一100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得1 μg/mL的混合标准储备液。

1.4.1.3 混合标准工作液的配制 分别精密吸取1 μg/mL的混合标准储备液10、20、50、100、200、500、1000 μL，置于不同10 mL容量瓶中，用复溶液定容，摇匀，即得浓度为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的混合标准工作液。

1.4.2 试液的制备

1.4.2.1 提取液的配制 分别取2%氨化乙腈50 mL和0.1 mol/L氢氧化钠溶液50 mL，充分混匀，即得。

1.4.2.2 磷酸盐缓冲液的配制 精密称取0.8 g磷酸二氢钾和0.2 g磷酸氢二钾，加80 mL水充分溶解后，定容至100 mL，混匀，即得。

1.4.2.3 酸性洗脱液的配制 取1 mL甲酸，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，即得。

1.4.2.4 碱性洗脱液的配制 取2 mL的浓氨水，加入50 mL甲醇、50 mL乙酸乙酯，混匀，即得。

1.4.2.5 复溶液的配制 取20 mL乙腈，加入80 mL 0.1%甲酸水，混匀。

1.4.3 空白粪污样品的筛选 选择太原市及周边多家猪、鸡、牛、羊养殖场，通过现场确认以及畜禽用药原始记录，有针对性地选取30 d内未使用过磺胺类和氟喹诺酮类药物的养殖场进行新鲜空白粪污样品的采集，方法确立前使用顾欣等建立的猪粪便中兽药残留量检测方法[6]进行样品前处理，上液质联用仪检测，选择对15种兽药均无明显干扰的样品作为相应基质的空白样品。

1.4.4 样品溶液的制备 采集的新鲜粪污样品，充分混匀，置-20 ℃冷冻保存。检测时，称取完全解冻的粪污样品1.00±0.02 g(精确到 0.01 g)，置于50 mL离心管中，准确加入提取液10 mL，充分涡旋30 s，震荡5 min，4 ℃下8000 r/min离心5 min，移出上清液。剩余残渣再加10 mL提取液重复提取一次，合并两次上清液，混匀，作为备用液1。

精密吸取2 mL备用液1于10 mL离心管中，40 ℃水浴条件下氮吹至近干。加入3 mL磷酸盐缓冲液溶解，涡旋30 s，4 ℃下8000 r/min离心5 min，取上清液作为备用液2。

取HLB 固相萃取小柱(3cc/60 mg)依次用3 mL甲醇、3 mL磷酸盐缓冲液进行活化。取备用液2过柱，用3 mL5%甲醇水溶液进行淋洗，抽干。用2 mL酸性洗脱液洗脱，抽干，作洗脱液1。再用2 mL碱性洗脱液洗脱，抽干，作洗脱液2。收集洗脱液1、2于同一个15 mL离心管中。于40 ℃水浴条件下氮吹至近干，用1 mL复溶液溶解残渣，溶液过0.22 μm滤膜(聚四氟乙烯膜)，供UPLC-MS/MS检测分析。

1.4.5 基质匹配标准溶液的制备 准确称取猪、鸡、牛、羊空白粪污样品各6份，每份1.00 g(精确至0.01 g)，按照1.4.4项下的方法进行提取、净化、氮吹，于六份空白样品中分别加入1 mL 的 1、2、5、10、20(猪、鸡、羊粪污)、50(牛粪污)、100 ng/mL 的混合标准工作液复溶，充分震荡，使残渣溶解，制成浓度为 1、2、5、10、20(猪、鸡、羊粪污)、50(牛粪污)、100 μg/mL的基质匹配标准溶液。进行超高效液相色谱-串联质谱测定，每个浓度溶液重复进样三次。获得15种兽药的基质匹配标准溶液浓度和峰面积，分别作为横坐标和纵坐标，绘制出相对应的目标兽药标准曲线。

1.4.6 空白样品溶液的制备 准确称取已初步筛选好的空白猪、鸡、牛、羊粪污样品1.00±0.02 g(精确到 0.01 g)，置于50 mL离心管中，照1.4.4项下步骤同步平行操作，得空白样品溶液。

1.4.7 检出限(LOD)与定量限(LOQ) 分别称取猪、鸡、牛、羊粪污空白样品各1 g，精密加入一定体积的混合标准储备液，按照1.4.4项下步骤处理样品，上机，计算信噪比(S/N)，以响应值最弱的组分信噪比为3时，对应的添加浓度为方法的检出限，以响应值最弱的组分信噪比为10时，对应的添加浓度为方法的定量限。

1.4.8 准确度和精密度样品溶液的制备 称取猪、鸡、牛、羊空白粪污样品各54份，每份1 g，分成3批，每批均精密加入一定体积的混合标准储备液，涡旋混匀，制成50、100、500 μg/kg低、中、高三个不同添加浓度的加标样品，每个浓度做6个平行样，按1.4.4项下步骤处理样品，照1.3项下仪器条件上机测定，用单点外标法定量，计算回收率和相对标准偏差；其中采用同批6个回收率数据计算批内相对标准偏差，采用3批平均回收率数据计算批间相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 基质效应 取上述1.4.5项下制备的10 ng/mL各基质匹配标准溶液，以及1.4.1.3项下纯溶剂配制的相同浓度的混合标准工作液，按照1.3项下仪器条件注入液质联用仪，以两者同一种兽药质谱响应值比值的百分数来评价基质效应(Matrix Effect，ME)，若ME大于100%，则存在基质增强效应；若ME小于100%，则存在基质抑制效应；若ME接近100%，则不存在基质效应。结果显示，15种兽药除磺胺嘧啶(SD)和诺氟沙星(Nor.)部分结果出现基质增强效应外，其余兽药均存在不同程度的基质抑制效应，尤其是磺胺喹噁啉(SQ)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)以及沙拉沙星(Sara.)基质抑制效应略微显著(图1)。为尽可能减少基质效应干扰，本实验采用基质标准曲线进行定量，虽然各个待测物存在不同程度的基质效应，但不影响检测结果。

图1 15种兽药在猪、鸡、牛、羊粪污中的基质效应Fig 1 Matrix effect of 15 veterinary drugs in pig, chicken, cattle and sheep manure

2.2 基质标准曲线 按照1.4.5项下步骤，猪、鸡、羊粪污制成浓度为 1、2、5、10、20、100 μg/mL基质匹配标准溶液，牛粪污制成浓度为 1、2、5、10、50、100 μg/mL基质匹配标准溶液，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。X轴为基质匹配标准溶液浓度C，Y轴为定量离子对应的色谱峰面积A，绘制15种兽药基质匹配标准曲线。结果表明：猪、鸡、牛、羊粪污中15种兽药在1～100 μg/mL浓度范围内线性关系均较良好，试验结果见表3。15种兽药基质匹配标准溶液及对应空白基质样品溶液色谱图见图2～图9。

表3 猪、鸡、牛、羊粪污中15种兽药基质匹配标准曲线回归方程及决定系数Tab 3 Regression equation and coefficient of determination of matrix matching standard curve for 15 veterinary drugs in pig, chicken, cattle and sheep manure

图2 空白猪粪污样品溶液色谱图Fig 2 Chromatogram of sample solution of blank pig manure

图3 猪粪污基质匹配标准溶液色谱图(浓度50 μg/kg)Fig 3 Chromatogram of matched standard solution of pig manure matrix (concentration 50 μg/kg)注：1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

图4 空白鸡粪污样品溶液色谱图Fig 4 Chromatogram of sample solution of blank chicken manure

图5 鸡粪污基质匹配标准溶液色谱图(浓度50 μg/kg)Fig 5 Chromatogram of matched standard solution of chicken manure matrix (concentration 50 μg/kg)注：1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

图6 空白牛粪污样品溶液色谱图Fig 6 Chromatogram of sample solution of blank cattle manure

图7 牛粪污基质匹配标准溶液色谱图(浓度50 μg/kg)Fig 7 Chromatogram of matched standard solution of cattle manure matrix (concentration 50 μg/kg)1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

图8 空白羊粪污样品溶液色谱图Fig 8 Chromatogram of sample solution of blank sheep manure

图9 羊粪污基质匹配标准溶液色谱图(浓度50 μg/kg)Fig 9 Chromatogram of matched standard solution of sheep manure matrix (concentration 50 μg/kg)1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

2.3 检出限(LOD)和定量限(LOQ) 测定结果表明，猪、鸡、牛、羊粪污中15种兽药残留检测方法的检出限为20.0 μg/kg，定量限为50.0 μg/kg。

2.4 准确度与精密度 分别取3批制备好的50、100、500 μg/kg低、中、高三个不同添加浓度各6个平行的加标样品溶液，上机测定，计算回收率和RSD，结果见表4。

表4 猪、鸡、牛、羊粪污中15种兽药添加回收率与精密度Tab 4 Recovery and RSD of 15 veterinary drugs added to pig, chicken, cattle and sheep manure

续表

结果显示，在50、100、500 μg/kg三个添加浓度下，猪、鸡、牛、羊粪污中15种兽药平均回收率为60.5%～115.5%，批内RSD(n=6)为1.2%～17.6%，批间RSD(n=3)为0.2%～17.6%。结果表明，该方法准确度、精密度良好。

2.5 样品测定 随机抽取从养殖场采回的8个畜禽粪污样品，用已建立的分析方法进行测定，每份样品取2个平行样，结果取平均值(表5)。

表5 畜禽粪污样品中15种兽药残留检测结果(n=2)Tab 5 Detection results of 15 veterinary drug residues in livestock and poultry manure samples (n=2)

由表5结果可知，恩诺沙星检出率75%，环丙沙星检出率62.5%，磺胺间甲氧嘧啶和诺氟沙星检出率均为25%，磺胺二甲基嘧啶、达氟沙星和氧氟沙星检出率均为12.5%，其余组分未检出。因数据有限无法体现山西省畜禽粪污兽药残留真实状况，需积累更多的样品数据，利用专业的统计学软件进行全方位多角度地分析。

3 讨论与结论

3.1 提取条件的选择 目前抗菌药物的提取主要采用有机试剂，部分使用无机试剂进行提取。甲醇、乙腈等有机试剂极性强，但是有一定的毒性作用，试验过程中曾采用水相提取试剂，分别采用磷酸盐缓冲液两次提取以及EDTA溶液和磷酸盐缓冲液分步提取的方式，后者较前者的回收率高，但ND代表未检出或检测结果低于检出限。

是回收率未达到60%以上，考虑与提取试剂的使用顺序有关，决定将EDTA和磷酸盐缓冲液区分前后顺序进行提取。结果：先用EDTA溶液再用磷酸盐缓冲液提取时，整体回收率未达到60%以上，先用磷酸盐缓冲液再用EDTA溶液提取时，磺胺类回收率达60%，氟喹诺酮仍然无法达到60%以上，因此，决定采用有机试剂进行提取，根据磺胺类和氟喹诺酮类抗菌药物的理化特性，采用碱性有机试剂进行提取，并对提取液和震荡时间进行考察。改变单一变量，以回收率作为评价指标，确定最终前处理方法。试验过程中发现震荡时间过长回收率略有降低，可能是震荡时间过长导致抗菌药物发生降解，影响提取效果，同涂宏建，钱诗颖等研究结果一致[8-9]。最终通过对比回收率确定将2%氨化乙腈+0.1 mol/L氢氧化钠溶液(50∶50，V/V)作为提取液，震荡5 min进行提取，回收率能够满足要求。

3.2 净化条件的选择 为了确定固相萃取方法步骤，课题组先后对固相萃取柱类型(C18柱、HLB3cc、HLB6cc)、复溶液、洗脱液以及淋洗液进行了一一考察。在保持其他前处理方法步骤一致的情况下，只改变单一变量，以回收率结果作为评价指标，选回收率高的变量为最终确定的方法。其中针对洗脱液的筛选优化，程家兴验证不同种类洗脱液对磺胺类和氟喹诺酮类的洗脱效果不同，结果酸性甲醇的洗脱效果总体较好[10]。但本试验单独采用酸性洗脱液或者碱性洗脱液，均不能使磺胺类和氟喹诺酮类的回收率达到“双赢”的结果，经多次反复试验，考虑到目标抗菌药物具有酸碱两性，最终采取酸性、碱性洗脱液分步洗脱的方式，两类目标抗菌药物的回收率均能同时满足要求。最终确定最佳的净化方式是提取液过HLB3cc固相萃取柱，5%甲醇水溶液淋洗，酸性洗脱液(1%甲酸甲醇)和碱性洗脱液(甲醇/乙酸乙酯/氨水，50/50/2，V/V/V)分步洗脱，浓缩，最后选用乙腈：0.1%甲酸水(20/80，V/V)进行复溶。

3.3 方法优化 本课题建立的检测方法能兼顾磺胺类及氟喹诺酮类药物均达到满意的回收率，且方法稳定性、精密度良好。对比国内外抗菌药物残留液质联用检测方法[11-12]，后期需要在确保杂质净化效果的前提下，进一步简化前处理步骤，提高方法的检测限，以便能建立更加高效、准确、快速、灵敏的畜禽粪污抗菌药残留检测方法。

本研究建立了一种SPE-UPLC-MS/MS同时适用于猪、鸡、牛、羊粪污中7种磺胺类、8种氟喹诺酮类兽药残留检测方法。通过考察，该方法准确度、精密度良好，方法可行。该方法的建立为后期进行山西省不同地区不同规模的养殖场粪污中的抗菌药物检测提供技术支撑，并为进一步研究兽药在环境中的迁移，对环境的影响提供检测方法和数据支持。