鸡滑液支原体的分离鉴定与多位点序列分型

田 野，朱 杰，陈 玲，杜鹏飞

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东滨州 256600)

鸡滑液支原体(Mycoplasmasynoviae, MS)可引起鸡和火鸡的呼吸道感染及传染性滑膜炎等病症，它可通过直接接触或呼吸道进行水平传播，也可以垂直传播，近年来在我国鸡群中广泛流行，造成了严重的经济损失。

目前，MS只有一个血清型，因此需要通过基因分型进一步明确MS的流行情况。通过MS基因型进行溯源分析，对于制定有效的预防、控制和根除MS的策略是至关重要的。常用的方法是通过VlhA基因进行分型，这是一种简单、经济的分型方式，但是区分度不足，适用于初步研究[1]。目前，EL-Gazzar等[2]建立了多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)方法，依靠多个管家基因积累的突变点进行分型，具有较好的分型效果。本研究针对2016-2021年间分离的MS菌株进行测序，同时结合NCBI基因库中的国内外MS菌株的数据进行MLST分型并建立进化树，以明确国内MS流行株所属的基因型及相互之间的进化关系，为我国养鸡业的MS防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 样品为来自山东、四川、河北、湖北、辽宁、安徽、江苏、黑龙江、宁夏共9省份疑似爆发MS感染鸡场的鸡腿、拭子等病料。

1.2 主要试剂 氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸镁等盐类购自国药集团，支原体培养基采用改良Frey氏培养基(购自OXOID)，辅酶购自罗氏。细菌DNA提取试剂盒和PCR mix购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 菌株的分离、纯化及鉴定 将关节液或拭子溶解在MS液体培养基中，通过0.45 μm滤器过滤除菌。将过滤液在37 ℃恒温箱中培养1～3 d，待变色后保种。将培养物10倍倍比稀释，选取合适的稀释度接种支原体固体培养基，在5% CO2培养箱中培养3～7 d后挑取单菌落，按同样方法进行3代的纯化后，使用明胶蔗糖保护剂进行冻干保种。通过OIE推荐的MS特异性引物进行分离株的鉴定(MS1-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA；MS2-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA)[3]。

1.4 多位点序列基因分型

1.4.1 DNA提取 取纯化保种的MS冻干菌种复溶，按照DNA提取试剂盒说明书进行MS分离株基因组模板的提取，置于-20 ℃条件下暂存。

1.4.2 引物合成 MLST引物参考El-Gazzar M等[2]建立的MLST方法设计，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

表1 引物信息Tab 1 Primer information

1.4.3 MLST目的基因扩增 PCR扩增体系(50 μL)：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，上游引物F(10 μmol/L) 2 μL，下游引物R(10 μmol/L)2 μL，ddH2O 18 μL，DNA模板3 μL，共50 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，54 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，共45个循环；72 ℃延伸5 min。取8 μL PCR产物通过1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.4.4 测序及序列分析 将PCR产物送往生工生物进行测序，将测序结果用Bio Edit进行编辑处理。

1.4.5 MLST分型 用DNAstar Lasergene7.1将测序的片段进行比对、剪切掉多余部分。整理后的Adk、Ppa、Gmk、nagC、Efp、atpG、recA测序片段在PubMLST官网上进行等位基因的查找(https:∥pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_msynoviae_seqdef&page=sequenceQuery)，并根据7个等位基因确定ST型(https:∥pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_msynoviae_seqdef&page=profiles&scheme_id=1)。

1.4.6 进化树的建立 将Adk、Ppa、Gmk、nagC、Efp、atpG、recA基因连接，通过Mega6.0软件完成进化树构建，bootstrap设置为1000，使用的MS参考株信息见表2。

表2 MS参考株信息Tab 2 Information of MS reference strains

续表

2 结 果

2.1 菌株的分离、纯化、鉴定结果 根据支原体菌落在固体培养基上呈“煎蛋状”的特征，结合OIE推荐的PCR方法[3]，共分离到MS菌株54株，菌株详细信息见表3。

表3 MS分离株ST分析结果Tab 3 ST analysis results of isolated strains

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2.2 MS分离株MLST分析结果 通过7个管家基因的等位基因定位，分离株的每个基因都包含3-5种类型(表4)，ST型可分为9种(表3)，其中以2种ST型为主，分别是34(31，占57.4%)、93(13，占24%)，其余7种ST型较少，分别为44(1)、95(1)、96(1)、102(1)、103(1)、148(4)、153(1)。

表4 管家基因的种类和数量Tab 4 The type and quantity of housekeeping genes

2.3 MS分离株遗传进化树的建立 将中国MS分离株建立进化树，通过进化关系可分为A～I类，进化树如图1所示。

图1 中国MS分离株进化树Fig 1 Phylogenetic tree of MS isolated strains from China

2.4 世界MS分离株遗传进化树的构建 将分离株与国内外参考株构建进化树(图2)，可发现分离株具有很强的地域性。所有菌株可分为亚洲株(中国株和西亚株)、欧洲株、北美株(NA-1、NA-2、NA-3)和其它株。其它株包含Others-1和Others-2，其中Others-1包含大洋洲(澳大利亚)、欧洲(意大利、匈牙利、西班牙)、北美洲(美国)和南美洲(巴西)等5个洲的分离株；Others-2包含亚洲(中国、黎巴嫩)、欧洲(匈牙利)、北美洲(美国)等3个洲的分离株。

图2 各国MS分类进化树Fig 2 MS classification phylogenetic tree of each country

3 讨 论

MS呈全球性分布，近年来包括中国在内的很多国家，MS爆发越来越频繁，引起了国内外科研工作者和养禽业的重视。针对2010-2015年的MS流行情况，马爽等[4]采用平板凝集方法对华北、华中、华南、华东、西北和东北地区11个省份的鸡场进行了血清学调查，表明均有MS感染，且抗体阳性率达30.23%～54.67%。Sun S等[5]对来源于16个省份的鸡血清进行检测，抗体阳性率高达63%，10周龄后的鸡阳性率最高。Xue J等[6]对中国21个省未接种疫苗的鸡群进行检测，总血清阳性率为41.19%。2018年，羊扬[7]对广西省3个黄羽肉鸡公司的鸡群血清进行了检测，结果显示群内抗体阳性率均高于80%。可见MS在我国广泛流行，情况不容乐观。

MS目前只有一种血清型，过去十几年常用N Jeffery等[8]设计的方法，即采用VlhA基因5’端的保守区进行基因分型，可将MS分为A～J等10种类型，是一种简单、经济的分型方式，适用于初步研究。Sun等[9]首次在中国发现新的K型基因，中国特有且该基因型属于中国最主要的基因型。谢迪等[1]采用VlhA基因对2016-2019年我国部分地区的48株MS分离株进行了分型，46株属于K型，1株属于A型，1株属于E型，进化树结果显示K型分支单一，基因亚型区分性差。

MLST分型采用了7对管家基因Adk、Ppa、Gmk、nagC、Efp、atpG、recA，等位基因包含的种类数量分别是29、36、44、25、29、66、41，种类丰富。世界上已鉴定的ST型达164种之多，中国分离株的ST型有23种，分别为34、90～104、145、147、148、151～154。MLST分型方法可以很好的区分不同的MS亚群，有利于MS的溯源和传播规律研究。本研究采用MLST方法将54株MS分离株进行测序分型。54个分离株包含9种ST型，其中34(31，占57.4%)、93(13，占24%)属于优势基因型，与谢迪等[1]研究基本一致。

统计至2021年10月，MS的MLST序列有275份，ST型有164种。其中，主要国家为中国、美国、匈牙利和意大利4国，占总MS菌株的85%(235/275)以上。本研究将MS分离株依据进化关系和地域分为亚洲株(中国株和西亚株)、欧洲株、北美株(NA-1、NA-2)和其它株(Others-1和Others-2)。Others-2是以MS经典株WVU为代表的分支，包含了亚洲的中国、黎巴嫩，北美洲的美国和欧洲的匈牙利，共3个洲4个国家的分离株，分离株数量很少，但在2013-2019年均有分离，因此可推断它是MS较原始的基因型，也有可能是因为种禽引进引起的跨地域传播。在图2中Others-1分支上，可看到澳大利亚MS-H分离株、非洲的突尼斯分离株IZSVE/6077/D12/1以及美国的MS2143分离株,在进化树上与部分欧洲分离的菌株相近，地缘关系远，可能与人类的交流活动有关。由以上数据可见，MS流行的地域性比较强，只有少量交叉传播。

本研究将国内的MS分离株通过进化树的形式进行了分型，可分为A～I共9种类型。虽然全球范围内MS分离株的地域性很强，但是在国内各省的地域分布上相关性不强。国内主要流行的是E类，其次是A、B、H类。C类、D类与其它分离株进化关系比较远，很少被分离到。F和G类是2019年后新分离的新菌株，与基因E型相近。关于近年MS爆发的主要原因，有观点认为是近年来种禽引进引起，也有观点认为是养鸡行业的快速无序扩张所致，根据本研究结果可推测本地MS菌株很早就存在。因此，对MS的综合防控需要对种源进行净化，并提升饲养管理水平，加强生物安全措施，同时采用药物和疫苗联合防控。