基于网络药理学的扶正调理液作用机制及其对S180荷瘤小鼠的影响

曹铭晨，彭小菊*， 黄先菊，柯才华 ，汪川，辛兆洋，于振英，潘冬琦，崔萌纳

(1.青岛大学附属医院，山东 青岛266000；2.中南民族大学，湖北 武汉 430074)

恶性肿瘤已成为当前严重威胁人类健康的主要疾病，我国的肿瘤发病率呈逐年上升趋势[1]。目前临床肿瘤治疗的主要手段包括手术治疗、放疗和化疗，患者放、化疗后极易出现食欲下降、免疫功能减退、骨髓抑制等一系列不良反应，进而诱发焦虑、抑郁等负面心理状态，降低生存质量[1-3]。中药治疗恶性肿瘤既古老又年轻，已成为当前肿瘤治疗的重要方法之一。基于数据挖掘技术提出的治疗恶性肿瘤中药复方主要包括扶正固本类、清热解毒类、活血化瘀类、软坚散结类、化痰利湿类等[1]，但大多以攻伐为主，虽然也有扶正兼以攻伐，也需随证配伍活血化瘀、理气、软坚散结、清热解毒、泻下攻积等峻猛之药[4]，若辩证准确，应用这些复方也能获得较好的临床疗效。而扶正调理液有别于其他抗肿瘤中药复方的主要特点是不用虎狼猛药，但调和气血阴阳、脏腑功能，调整机体平衡。该配方源于青岛市科技局立项课题中“增龄I 号”[5]，由灵芝、黄芪、炒白术、茯苓、生地黄、黄精、制何首乌、玉竹、枸杞、淫羊藿、炒莱菔子、生蒲黄、木香、蒲公英、三七组成。方中以灵芝、黄芪共为君药，补气健脾宁心；炒白术、茯苓、生地黄、黄精、制何首乌、玉竹、枸杞、淫羊藿共为臣药，补益气血阴阳、五脏六腑；佐以三七、蒲黄、木香、莱菔子活血理气、通达血脉及胃肠；最后在诸多补益之药中配伍清热解毒、利尿行水的蒲公英，使气机条达、经血通畅、二便得利、毒邪可祛，诸药共奏扶正补虚、理气活血、解郁祛邪、调理阴阳之功。本方经彭小菊主任大量临床应用于亚健康人群和恶性肿瘤病人，目前已获国家发明专利[6]。临床观察发现，扶正调理液能够显著改善中老年冠心病患者心绞痛症状,降低胆固醇、三酰甘油、SOD(超氧化物歧化物)和MDA(丙二醛)值，有较好的降脂、抗衰老、抗氧化作用[5]。扶正调理液通过提高肿瘤及亚健康患者的睡眠质量、减轻疲劳，改善焦虑、抑郁等负面心理状态[2]，达到升高肿瘤化疗患者的白细胞总数及中性粒细胞数量[3]，提高机体免疫功能，减轻放、化疗不良反应以提高耐受性和依从性的目的，改善恶性肿瘤患者的生活质量。近年来运用网络药理学的方法探讨单味或复方中药抗肿瘤作用机理的研究较多[7-9]，但通过运用中药复方改善肿瘤患者体质，或降低西医治疗的不良反应来提高肿瘤患者生存质量的分子作用机制证据尚显不足。 本文基于网络药理学方法初步预测扶正调理液的分子作用机制，通过S180荷瘤小鼠模型验证扶正调理液对肿瘤生长及免疫器官的影响，以期为临床应用提供科学的理论依据。

1 研究工具、仪器与材料

1.1 研究工具

基于BATMAN-TCM在线分析平台(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[10]获取扶正调理液活性成分并预测可能的相互关系靶点的基因信息；应用Cytoscape 3.5.1软件[11]构建化合物-疾病-靶点相互作用网络；基于DAVID数据库(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)(https://david.ncifcrf.gov/)[12]、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)(https://www.kegg.jp/)[13]、STRING数据库(https://www.string-db.org/)[14]、生物分子通路数据库(Reactome)(http://www.reactome.org)[15]、R语言包3.5.1(R version 3.5.1)[16]进行通路富集分析。

1.2 仪器与材料

1.2.1 实验动物及瘤株

昆明种雄性小鼠，体质量18～22 g，由湖北省疾病预防控制中心提供；S180腹水瘤细胞购自中国上海典型培养物保藏中心，动物实验经医学实验动物管理委员会批准。

1.2.2 实验仪器

SW-CJ-2F超净台(苏州净化设备有限公司),MLS-3781L高压灭菌锅(日本三洋公司),Mettlerae240十万分之一天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司),Thermo 21R离心机(美国Thermo公司),Advantage A5超净纯水器(美国密理博公司),DW-86L388A超低温冰箱(中国海尔公司)。

1.2.3 实验药物

顺铂粉针剂(规格：10 mg/瓶，批号：041115，齐鲁制药有限公司)；扶正调理液饮片购于青岛大学附属医院药剂科，经煎煮后浓缩至药材质量浓度0.5 g/mL。每次给药前现取混匀后使用，药物储存在4 ℃条件下。

2 方法与结果

2.1 基于BATMAN-TCM构建扶正调理液靶点的作用网络

BATMAN-TCM是一款中药成分分子机制的生物信息学分析工具，采用基于相似度的目标靶点预测方法，根据潜在的药物-靶标相互作用与已知药物-靶标相互作用的相似性排序[10]，模型预测性能可信度较高。预测相关参数设置Select input type：Herb or Herb list；Herb or Herb list (Pinyin/Latin/English name one herb per line)：LING ZHI, HUANG QI,CHAO BAI ZHU,FU LING,SHENG DI HUAG,HUANG JING,ZHI HE SHOU WU,YU ZHU,GOU QI,YIN YANG HUO,LAI FU ZI,PU HUANG,MU XIANG,PU GONG YING,SAN QI；Input parameter Score cutoff：20；P-value after Benjamini-Hochberg multiple testing correction (AdjustedP-value)：0.05。预测扶正调理液活性成分相关的target name、gene、fit score等参数，筛选BATMAN-TCM相似度评分>48的关键靶点共400个，涉及活性化合物358个。根据已知和预测的候选目标蛋白，选择靶点连接数>12，绘制包含相关生物途径和TTD(治疗靶点数据库)疾病表型的化合物-靶点-通路-疾病作用网络图(图1，P<0.05)，BATMAN-TCM在线分析提示该相互作用网络中关键靶点包括雌激素受体1(ESR1)、κ型阿片受体(OPRK1)、糖皮质激素受体 (NR3C1)、盐皮质激素受体(NR3C2)、腺苷A1 受体 (ADORA1) 等，涉及的关键疾病包括癌症(非特异性)、疼痛、乳腺癌、心血管疾病、炎症反应、前列腺癌、高血压、类风湿关节炎、阿尔茨海默氏病、抑郁、动脉粥样硬化等，体现中医药整体观念及中药组方配伍的多成分-多靶点-多通路调控疾病的作用特点。

图1 扶正调理液多成分-多靶点-多通路调控疾病的网络Fig.1 Multi component-multi target-multi pathway regulation network of Fuzheng Tiaoli Decoction

2.2 构建关键靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络

STRING数据库基于目前已知和预测的蛋白质之间直接、间接相互作用信息，通过计算每个蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)程度的P值，P值高则PPI的置信度高。上传BATMAN-TCM平台相似度评分>48的400个扶正调理液关键靶点基因ID至STRING在线数据库，获取PPI信息，选取P>0.95的置信度的蛋白关系，构建扶正调理液关键靶点蛋白在系统水平上的PPI网络(图2)。

图2 扶正调理液靶点PPI网络Fig.2 The PPI network of key targets of Fuzheng Tiaoli Decoction

网络拓扑学分析结果显示，该网络的平均介数=0.318，平均度值=1.62，PPI富集P< 1.0×10-16。基于INTERPRO Protein Domains and Features(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)、SMART Protein Domains(http://smart.embl-heidelberg.de/)、PFAM Protein Domains(http://pfam.xfam.org/)数据库对PPI网络靶点进行生物学聚类分析，根据错误发现率(false discovery rate)提示关键靶点主要涉及神经递质门控离子通道、离子转运蛋白、3′5′-环核苷酸磷酸二酯酶、蛇形7TM GPCR化学受体、具有保守的“ HD”基序的金属依赖性磷酸水解酶、连接的离子通道L-谷氨酸和甘氨酸结合位点、脯氨酰4-羟化酶α亚基同源物等。

2.3 GO富集分析

基于DAVID V6.8数据库，采用改进的Fisher精确检验算法进行基因本体(gene ontology, GO)富集分析，探索扶正调理液靶点基因在基因功能中的作用，应用R软件根据P值(P<0.005)绘制GO富集分析结果点状图(图3)，其中细胞成分包括细胞质、细胞溶质、细胞质膜、线粒体等；分子功能包括氧化还原酶活性、跨膜转运蛋白活性、裂解酶活性、酶结合等；生物过程包括小分子代谢过程、细胞氨基酸代谢过程、细胞间信号、稳态过程、脂质代谢过程等。

图3 GO通路富集分析点状图Fig.3 The scatter chart of GO pathway enrichment analysis

2.4 Reactome生化反应通路富集分析

Reactome是基于PSIQUIC Web服务将来自反应组功能相互作用网络和外部相互作用的生物信息学数据库(如IntAct(https://www.ebi.ac.uk/intact/)，BioGRID(https://thebiogrid.org/)，ChEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)，iRefIndex(http://irefindex.uio.no/)，MINT(https://mint.bio.uniroma2.it/)和STRING)的分子相互作用数据对数据集进行富集分析，结果偏重于生化反应通路信息。根据错误发现率由低至高绘制Reactome途径-基因圈图(图4)，结果提示扶正调理液主要涉及神经元系统、跨化学突触的传递、神经递质受体和突触后信号传递、代谢、胺配体-结合受体、心脏传导、G蛋白偶联受体(GPCR)下游信号、通过GPCR发出信号等通路。

图4 Reactome生化反应通路富集分析结果Fig.4 Reactome biochemical reaction pathway enrichment analysis results

2.5 KEGG 通路富集分析

应用DAVID V6.8数据库对扶正调理液靶点进行KEGG生物通路富集分析，靶点基因列表导入DAVID数据库，勾选OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Gene list、Submit list，选择基因功能分类工具，修改背景为人类，选择Pathway，筛选P<0.01的通路为可靠通路进行注释分析。应用R语言根据P值(P<0.05)对主要代谢通路绘图分析(图5)。结果主要涉及神经活动配体-受体相互作用，精氨酸和脯氨酸代谢，钙信号通路，血清素能突触，嘌呤代谢，味觉转导，酪氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，氨酰基-TRNA的生物合成，CGMP-PKG信号通路，多巴胺能突触，GABA能突触，胆碱能突触，氨基酸生物合成，碳代谢，唾液分泌，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，胃酸分泌，TRP通道的炎症介质调节，类固醇激素的合成，长期抑郁等途径。

图5 KEGG通路富集分析点状图Fig.5 The scatter chart of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 扶正调理液对S180荷瘤小鼠饮食、肿瘤生长及免疫器官的影响

小鼠给药30 d后停止给药，称取体质量。在末次给药24 h后，将小鼠颈椎脱臼处死，迅速解剖剥取瘤块、脾脏和胸腺并剥离被膜，分别记录各脏器质量，计算脏器指数。抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数按下式计算：

抑瘤率=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%

脾脏指数=脾脏质量(g)/小鼠体质量(g)

胸腺指数=胸腺质量(g)/小鼠体质量(g)

所有样本重复测定3次，数据分析应用统计分析软件SPSS 19.0，数据以平均值±标准差(X±SD)表示，多组间计量资料比较采用 One-way ANOVA单因素方差分析，P<0.05 为存在显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

2.6.1 扶正调理液对小鼠进食量和体质量的影响

结果显示扶正调理液低、高剂量组小鼠的精神状态和被毛的光泽度优于阳性组及阴性组。结果如图6～7所示。低、高剂量组小鼠的单位质量进食量显著高于阳性组及阴性组(P<0.05)；阴性组、阳性组和低剂量组的28 d体质量增长率分别为20.13%、12.12%和13.84%、而高剂量组小鼠的28 d体质量增长率为28.52%，显著高于其他各组(P<0.05)。

图6 小鼠单位质量进食量变化趋势Fig. 6 Graph showing the changing trends in food intake per unit mass of mice

图7 扶正调理液对小鼠体质量增长率的影响Fig.7 The effect of Fuzheng Tiaoli decoction on the growth rate of mice body mass

2.6.2 小鼠肿瘤质量及肿瘤抑制率比较

结果如图8所示，阴性组平均瘤质量(1.65±0.24)g(图中抑瘤率根据阴性组肿瘤质量计算)；阳性组平均瘤质量(0.86±0.11)g，肿瘤抑制率47.89%；扶正调理液低剂量组平均质量(1.51±0.27)g，肿瘤抑制率仅为8.73%；而高剂量组平均瘤质量(1.33±0.16)g，肿瘤抑制率19.54%，各组间比较存在显著性差异(P<0.01)。

图8 S180荷瘤小鼠肿瘤抑制率Fig.8 Tumor inhibition ratein S180 tumor-bearing mice

2.6.3 小鼠脏器指数的比较

结果如图9所示，阴性组、阳性组、扶正调理液低剂量组和高剂量组的胸腺指数分别为0.003 24±0.000 23、0.003 67±0.000 31、0.003 47±0.000 26和0.003 43±0.000 31，低剂量组和高剂量组的胸腺指数不存在显著性差异(P>0.05)，低于阳性组但显著高于阴性组(P<0.05)，提示扶正调理液可以显著增加S180荷瘤小鼠的胸腺质量，改善胸腺萎缩程度。脾脏指数分别为0.079 3±0.008 4、0.079 8±0.007 1、0.070 3±0.006 5和0.058 3±0.051 9，阴性组和阳性组脾脏指数不存在显著性差异(P>0.05)，高剂量组显著低于阳性组(P<0.01)，提示扶正调理液可以显著改善S180荷瘤小鼠的脾脏肿大的状态。

注：*P<0.05， **P<0.01，与阴性组相比。图9 扶正调理液对S180荷瘤小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响Fig. 9 The effect of Fuzheng Tiaoli Decoction on thymus and spleen indices of S180 tumor-bearing mice

3 讨论与结论

恶性肿瘤患者普遍存在较高程度的营养不良问题，营养风险会对肿瘤预后及临床结局产生一定的负面影响[17]；同时，这些患者普遍有焦虑、失眠、郁闷、烦躁等不良情绪。临床应用扶正调理液时发现其显著改善肿瘤及亚健康患者的睡眠质量，减轻疲劳，改善焦虑、抑郁等负面心理状态[3]，显著升高恶性肿瘤化疗患者的白细胞总数及中性粒细胞数量[4]。 经本文研究，Reactome富集分析结果提示扶正调理液主要涉及神经元系统、跨化学突触的传递、神经递质受体和突触后信号传递、代谢、GPCR信号通路等。KEGG通路富集分析结果涉及更为丰富的生物学通路，与Reactome富集分析结果有异曲同工之妙，相关通路也主要与神经系统和代谢途径相关：如与精神状态相关通路包括神经活动配体-受体相互作用、钙信号通路、GABA能突触、胆碱能突触、多巴胺能突触、长期抑郁等，其中大多数通路属于GPCR相关通路；与进食相关的通路包括血清素能突触、味觉转导、唾液分泌、胃酸分泌等；与营养代谢相关的通路包括各类氨基酸和生物合成及代谢过程、氨酰基-TRNA的生物合成、碳代谢、嘌呤代谢等。

扶正调理液显著增加了S180荷瘤小鼠的单位质量进食量和营养状况，高剂量组小鼠的精神状态和被毛光泽度优于阳性组及阴性组，高剂量组28 d体质量增长率为28.52%，显著高于其他组(P<0.05)。临床观察和动物实验研究结果均显示，扶正调理液具有改善焦虑、抑郁等负面心理状态和改善睡眠质量等作用，这可能与关键靶点OPRK1、NR3C1、NR3C2、ADORA1密切相关。KEGG、Reactome通路富集分析结果提示扶正调理液相关通路与神经系统密切相关，关键靶点如OPRK1、NR3C1、NR3C2主要涉及强啡肽能系统和皮质醇系统。强啡肽能系统参与神经性疼痛的传递，强啡肽根据其阿片样物质或非阿片样物质的作用发挥抗伤害感受的作用，通过脑皮质回路影响疼痛的负性情感[18]。OPRK1及其内源性配体强啡肽可介导行为对厌恶或压力性经历的反应[19]，接触应激通过增加边缘区域的强啡肽水平[20]，激活OPRK1引起啮齿动物烦躁不安和抑郁样行为[21-22]。近年来研究发现皮质醇对压力的影响可能取决于与压力途径相关基因的表达水平，其中主要涉及NR3C1、NR3C2基因表达与精神状态和精神压力转化相关疾病密切相关，涉及了精神分裂症、抑郁症、狂躁症、精神障碍等多种神经系统疾病[23-25]，提示扶正调理液影响皮质醇系统相关基因的表达可能是其发挥改善精神系统症状的重要途径之一。此外，NR3C1、NR3C2也与多种肿瘤的进展密切相关，如NR3C1与前列腺癌、结直肠癌、大肠癌等的进展密切相关[26-28]，NR3C2的表达介导胶质母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、结直肠癌等恶性肿瘤的进展[29-31]。

GO富集分析结果提示细胞成分方面涉及细胞质、细胞溶质、细胞质膜、线粒体等生物途径。肿瘤的发生和转移与肿瘤所处的微环境密切相关，肿瘤微环境不仅包括癌细胞本身，还包括周围的基质细胞、免疫细胞、内皮细胞、生长因子以及特殊的生理生化条件，肿瘤微环境与肿瘤细胞相互作用共同介导了肿瘤的免疫耐受[32]。腺苷受体在肿瘤的免疫耐受过程中起到了非常重要的作用，腺苷受体通过P1型嘌呤受体(ADOA1R、ADOA2AR、ADOA2BR、ADOA3R)介导抗炎症效应[33]。腺苷受体也属于G蛋白偶联受体家族，广泛表达于包括免疫细胞在内的多种细胞。腺苷受体通过其受体抑制NK细胞、DC细胞、CTL等功能的发挥，同时增强免疫抑制细胞的活性，参与肿瘤微环境免疫耐受的形成[32]。腺苷受体作用于血管内皮细胞及基质细胞，促进肿瘤微环境新生血管的形成，为肿瘤的转移提供必要条件，使其成为抗肿瘤药物研究的重要靶点之一[32]。已有研究表明，ADORA1抑制介导肿瘤的免疫逃逸进程[32-33]，此外还有研究指出ADOR1的表达也参与了抗抑郁样作用[34-35]，提示扶正调理液通过影响ADOR1的表达改善肿瘤患者的精神状态或影响肿瘤进展，非常值得进一步深入研究。

本研究开展的动物实验结果显示，扶正调理液显著改善S180荷瘤小鼠脾脏肿大和胸腺萎缩的组织病变情况，增强荷瘤小鼠免疫器官功能，增加小鼠进食量、体重和毛发光泽度等，与文中网络药理学的研究结果不谋而合。本研究提示扶正调理液可能通过影响OPRK1、NR3C1、NR3C2、ADORA1、ESR1等基因的表达，影响神经活动配体-受体相互作用、钙信号通路、血清素能突触、味觉转导、氨基酸代谢、唾液分泌等信号通路，改善焦虑、抑郁等负面心理状态，改善睡眠质量、减轻疲劳、改善食欲和营养状况，增强免疫功能，抑制肿瘤的进展，体现中药复方的多靶点和整体性的作用特点，为进一步研究扶正调理液分子作用机制提供了新思路。