基于疏肝解郁功效的逍遥散寒苦肝和温辛肝性效关系研究

师建茹，高耀，赵慧亮，田俊生*，武嫣斐*

(1. 山西医科大学第一医院, 山西 太原 030001；2. 山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006)

抑郁症是以情绪异常低落为主要临床表现的精神疾病，严重者可能导致自杀，具有发病率、复发率、致残率高等特点，到2030年将成为全球仅次于缺血性心脏病的第二位疾病负担源，其危害已引起全世界医药卫生界的重视[1-2]。对个人而言，其年患病率为6.6%，而终身患病率高达 16.2%[3]。目前临床多用西药治疗，但有一定的毒副作用。因此，寻找有效、安全、依从性好的治疗方法受到人们的普遍关注。

抑郁症多归属于中医“郁证”范畴，《医碥》言“郁而不舒，则皆肝木之病。”由此可见肝与郁证密不可分。陈士铎《石室秘录》言 “夫郁者，未有不伤肝者。”为后世医家从肝论治郁证奠定了理论基础。叶天士《临证指南医案·郁》所载的医案均属情志之郁，治则多以舒肝理气为主。同时有部分学者提出肝主疏泄，对于应激事件所产生的反应起到关键的调节作用，这与中医认为肝失疏泄致抑郁症发病的观点不谋而合[4]。

逍遥散源于宋代《太平惠民和剂局方》，由柴胡、当归、炒白术、茯苓、炙甘草、生姜、白芍、薄荷 8 味药组成，具有疏肝解郁、养血健脾的功效，是疏肝解郁的经典方之一。实验研究和临床应用均表明[5-8]，逍遥散具有确切的治疗抑郁症的作用。柴胡[9]、白芍[10]、当归[11]、薄荷[12]单味药也具有抗抑郁的功效。施学丽等[13]采用应用关联规则、聚类方法等数据挖掘技术分析治疗抑郁症的中药专利复方组方配伍规律，发现逍遥散为治疗抑郁症的基本方。因此，围绕逍遥散的药性与功效的内在联系研究逍遥散抗抑郁的作用机制具有重要意义。

《神农本草经》序录云“药有酸咸甘苦辛五味，又有寒热温凉四气。”四气，就是寒热温凉四种不同的药性，又称四性，反映了药物对人体阴阳盛衰、寒热变化的作用倾向，为药性理论重要组成部分。药性的寒热温凉是根据药物作用于人体产生的不同反应和疗效总结出来的，其与所治疾病的性质是相对而言的[14]。王耘等[15]提出药性组合与功效相结合的研究思路，从药性角度分析抗衰老中药并阐释不同类别的药性特征。吴东雪等[16]以代表性中药的活性成分作用靶标及其蛋白质-蛋白质相互作用( protein-protein interaction，PPI)网络模块的功能识别为桥梁，衔接药性和功效，探讨活血化瘀药性效关系。侯宁等[17]进行了基于药性组合的丹参和红花的性效关系研究。朱艳玲[18]总结了归肝经药物四性规律，归肝经性寒凉药物居多，从五味分析，辛味或苦味居多；归肝经性温热药物，从五味分析，味辛者居多。

因此，本实验围绕逍遥散中温辛肝药性、寒苦肝药性进行分析，以逍遥散中柴胡、白芍(寒苦肝药性、寒苦心药性)、当归、薄荷(温辛肝药性、温辛心药性)为研究载体，通过成分-靶点-蛋白分析，构建药性组合PPI网络，说明柴胡、白芍、当归和薄荷同归肝经药性的共性特征和寒苦药性、温辛药性在发挥疏肝解郁功效上的差异，从而阐释疏肝解郁中药气味组合与功效的内在联系。

1 材料与方法

1.1 研究载体的选取

中药的性能，是指药物与疗效有关的性质与功能，四气、五味为中药的基本药性。2020年版《中国药典》[19]中记载柴胡味苦、辛，性微寒，归肝、胆经，功能疏散退热，疏肝解郁，升举阳气；白芍味苦、酸，性微寒，归肝、脾经，功能养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳；当归味甘、辛、苦，性温，归肝、心、脾经，功能补血活血，调经止痛，润肠通便，润燥滑肠；薄荷味辛，性温，归肺、肝经，功能疏散风热，清利头目，利咽，透疹，疏肝行气。肝与郁证密不可分，因此本文对肝经进行深入的研究。本文选择具有疏肝解郁功效的寒苦肝药性和温辛肝药性作为研究载体，其中寒苦肝药性选取了柴胡和白芍，温辛肝药性选取了当归和薄荷。

1.2 中药成分的筛选

以逍遥散中寒苦肝药性为例，利用TCM database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)[20]、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)[21]、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[22]数据库结合文献挖掘的方法收集柴胡、白芍的主要化学成分，汇总得到寒苦肝药性中柴胡和白芍的主要有效成分。同理可获取温辛肝组合中药当归和薄荷的主要有效成分。

1.3 药性组合靶点网络的预测

应用BATMAN-TCM 分析平台，在线获取逍遥散中寒苦肝药性中柴胡和白芍主要有效成分的靶点信息，并选择其中高可信度的蛋白作为候选靶点(prediction score cutoff >20)。由于检索到的药物靶点存在命名不规范等问题，因此，本实验使用 UniProt 数据库中 UniProtKB 搜索功能(http://www.uniprot.org/，Update in 2014-04-10)，通过输入蛋白名称并限定物种为人，将检索得到的所有蛋白校正为其官方名称(official symbol)，经上述数据库检索和转化操作，获取与活性成分相关的靶点信息。同理可获取逍遥散中温辛肝药性中中药当归和薄荷的主要有效成分靶点。

1.4 药性组合靶点网络的构建

将靶点信息整合后导入Cytoscape 3.5.1 平台，应用Advanced Network Merge 插件[23]中的Union计算得到全集网络，即逍遥散中寒苦肝药性靶点网络；同理构建逍遥散中温辛肝药性靶点网络。应用Advanced Network Merge插件中的Intersection和Difference计算对上述2个药性组合靶点网络取交、补集，分别得到交集靶点群为2个药性组合共有靶点集，即逍遥散中归肝经药性的作用靶点群，补集部分分别为逍遥散中寒苦药性的独特靶点群和温辛药性的独特靶点集。通过对2个药性组合靶点网络的交补集进行分析，可以对比解析逍遥散中归肝经药性的共性特征和寒苦药性疏肝解郁药的特异性特征及温辛药性疏肝解郁的特异性特征。

1.5 药性组合靶点网络的构建

使用Metascape数据库[24]对药性组合蛋白进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG )通路分析，设置阈值P< 0.01，筛选出排名靠前的 KEGG 通路。Metascape 采用一种启发式算法从得到的簇中选择信息量最大的术语。KEGG通路P值越小，标记的颜色越深。节点可以通过其群集ID或其P值进行着色。边缘连接相似的术语越多，相似性越高。分别构建逍遥散中归肝经药性靶点网络、寒苦药性靶点网络和温辛药性靶点网络并进行功能分析。对上述功能注释进行分类和对比，结合文献及数据库，研究逍遥散中归肝经药性的共性特征及寒苦药性、温辛药性的特异性特征。同时，基于中药药性理论，结合文献中对靶点和模块的现代药理学研究，分析逍遥散中疏肝解郁中药的化学和生物学基础，阐释药性与功效的内在联系。本文具体技术路线见图1。

图1 逍遥散中寒苦肝和温辛肝性效关系研究技术路线图Fig.1 Technical roadmap for the nature-effect relationship research of cold bitter and warm pungent medicinal properties of Xiaoyaosan

2 结果

2.1 药性组合成分和靶点信息

通过 TCM database@Taiwan、TCMID 和BATMAN-TCM 等数据库及文献挖掘，筛选高可信度的蛋白作为候选靶点，去除没有对应靶点的成分。筛选结果：柴胡共 67 个成分，白芍共 18 个成分，当归共 97 个成分，薄荷共 23 个成分，共获得 85 个逍遥散中寒苦肝药性有效成分和 116 个温辛肝药性有效成分。作用靶点来源于BATMAN-TCM 分析平台，去除重复靶点，共获取逍遥散中寒苦肝药性作用靶点 1127 个，温辛肝药性作用靶点 1389 个，部分靶点信息见表 1。经筛选后 2 个药性的有效成分个数存在差异，但以相同方法获取靶点后，2 个药性组合的靶点数相当，对后续的网络构建和模块识别影响较小，故有效成分数量的差异，对最终的分析结果无较大影响。

表1 逍遥散中药性组合的部分靶点信息Table 1 Partial target information of drug combinations in Xiaoyaosan

2.2 药性组合PPI网络的构建

搜索 STRING 数据库，获取各靶点相关的PPI信息。以交集逍遥散中苦肝药性靶点网络为例，将靶点网络的PPI信息导入 Cytoscape 3.5.1，取最大连通子图为归肝经药性的PPI网络。该网络包含 946 个节点、6748 条边。同理，构建逍遥散中寒苦药性靶点的PPI网络和温辛药性靶点的PPI网络。其中逍遥散中寒苦药性靶点的PPI网络包括28个节点、24条边；温辛药性靶点的PPI网络包含 274 个节点、899 条边。

2.3 不同组合药性PPI网络的功能分析

通过 Metascape 对不同组合药性PPI网络进行KEGG功能分析，其中，逍遥散中归肝经药性PPI网络主要通过调节神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP 信号通路、多巴胺能突触、血清素能突触、胆碱能突触、酪氨酸代谢、味觉传导、嘌呤代谢、TRP通道的炎性介质调节、MAPK 信号通路、色氨酸代谢、肌萎缩侧索硬化、Rap1 信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢、甾体激素生物合成等发挥疏肝解郁的功效。如图 2 所示。

图2 逍遥散中归肝经药性KEGG通路图Fig.2 KEGG pathway of the liver meridian medicinal property of Xiaoyaosan

逍遥散中寒苦药性PPI网络主要通过调节胆汁分泌、MAPK 信号通路、IgA 产生的肠道免疫网络、催产素信号通路、Hipp 信号通路、HIF-1 信号通路、胰岛素抵抗、心肌细胞肾上腺素能信号通路等发挥疏肝解郁的功效，如图3所示。

图3 逍遥散中寒苦药性KEGG 通路图Fig.3 KEGG pathway of the cold bitter medicinal property of Xiaoyaosan

逍遥散中温辛药性PPI网络主要通过调节神经活性配体-受体相互作用，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，嘧啶代谢，cAMP信号通路，氨基酸生物合成，维生素消化和吸收，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，神经营养因子信号通路，肾素-血管紧张素系统，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，胆碱能突触，甘油磷脂代谢等发挥疏肝解郁的功效，如图 4 所示。

图4 逍遥散中温辛药性KEGG 通路图Fig.4 KEGG pathway of the warm symplectic medicinal property of Xiaoyaosan

从统计分析结果可以看出(表2)，逍遥散中寒苦药性PPI网络和温辛药性PPI网络均与维生素转运、胰岛素抵抗有关。温辛药性、归肝经药性和温辛药性PPI网络均与神经活性配体-受体相互作用、cAMP 信号通路、胆碱能突触有关。逍遥散中寒苦药性、归肝经药性和温辛药性PPI网络均与 MAPK 信号通路、肾上腺素能信号通路的反应有关。逍遥散中寒苦药性、温辛药性和归肝经药性PPI网络均与行为学有关。逍遥散中疏肝解郁中药可以通过影响上述信号通路等发挥抗抑郁的作用。因此推测这3个PPI网络中的中药可能具有预防和治疗抑郁症的作用。

表2 逍遥散中不同药性的功能列表Table 2 A list of functions of different medicinal properties of Xiaoyaosan

进一步对逍遥散中寒苦肝药性和温辛肝药性性效关系进行梳理，如图5所示。逍遥散中寒苦药性蛋白PPI网络的通路富集发现，逍遥散中寒苦药性对应的功能包括能量代谢和炎症反应；逍遥散中温辛药性PPI网络的通路富集发现，逍遥散中温辛药性对应的功能包括神经营养和氨基酸代谢。逍遥散中归肝经药性PPI网络的通路富集发现，逍遥散中归肝经药性蛋白对应的功能包括神经递质、信号通路和内分泌。由此发现，不同药性网络对应不同的功能，这些功能可能在逍遥散抗抑郁中发挥重要的作用。

图5 逍遥散中寒苦肝药味和温辛肝药味性效关系Fig.5 The relationship between the taste of cold and bitter liver medicine and the taste of warm pungent liver medicine of Xiaoyaosan

3 讨论

PPI网络是由各个蛋白质之间的相互作用组成的，这些蛋白参与生命过程的许多方面，例如生物信号传递、基因表达的调控、能量代谢等。对生物系统中大量PPI的分析有助于理解疾病发病的复杂机理以及药物治疗疾病的复杂机制。本研究通过数据库检索获取逍遥散中温辛肝药性、寒苦肝药性的主要有效成分及作用靶点，对药性PPI网络进行功能注释和统计分析。该研究从分子网络水平阐释了逍遥散中归肝经药性的共性特征和寒苦药性、温辛药性的特异性特征。

归肝经药物的性效规律与肝脏生理功能、病理特点关系密切。实验结果表明，逍遥散归肝经药性PPI网络主要通过 HTR2B 等靶点参与神经递质、信号通路、内分泌发挥疏肝解郁的功效[25]。因此推测出逍遥散归肝经药性PPI网络具有疏肝解郁的功效。

归肝经药性寒凉的药物味苦者最多，性寒味苦者清热解毒的作用更大，治疗热性和热毒病证，同时还具有清热利湿、利水、止痛等的功效。实验结果表明，逍遥散寒苦药性网络通过 CREBRF 等靶点参与能量代谢、炎症反应发挥疏肝解郁的功效[26-27]，所以可以推测出逍遥散寒苦药性PPI网络具有疏肝解郁的功效。

归肝经药性温热的药物味辛者最多，最明显的功效是祛风、除湿、强筋骨、止痛，反映出辛能行能散，还具有活血化瘀、行气的功效。实验结果表明，逍遥散中温辛药性主要通过 ADCY5等靶点参与神经营养、氨基酸代谢发挥疏肝解郁的功效[28]。所以可以推测出逍遥散中温性药性PPI网络具有疏肝解郁的功效。

虽然，逍遥散中寒苦药性PPI网络和温辛药性PPI网络通过不同的靶点共同参与调节细胞对胰岛素抵抗等生命过程而发挥作用，但从功能分析结果可以发现两者是通过不同的靶点发挥作用的。本文通过构建逍遥散中温苦肝药性、寒苦肝药性两个药性组合中药成分的PPI网络，并基于模块聚类分析方法对这两个药性PPI网络的交补集进行综合分析，从分子网络水平说明了逍遥散中归肝经药性的中药可能具有神经递质、信号通路、内分泌等疏肝解郁功效。

逍遥散中寒苦药性PPI网络通过调节能量代谢、炎症反应发挥功效。逍遥散中温辛药性PPI网络具有调节神经营养、氨基酸代谢等功效，其中寒苦药性PPI网络和温辛药性PPI网络通过不同的靶点共同参与调节细胞对胰岛素抵抗等生命过程而发挥作用。“肝郁”是逍遥散应用的基础，这些重要的生物学功能与药性的关系用现代科学术语阐明了逍遥散疏肝解郁功效的科学内涵，为逍遥散中的药性与功效的内在联系研究提供了新思路和方法。