TWIST1在人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及血管形成中的作用

谢月樵， 郭丹， 王楠， 尤娜， 黄琬玲， 马小彤

中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所），北京协和医学院，实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，细胞生态海河实验室，天津300020

实体肿瘤的进展过程中一般伴随血管新生，以满足肿瘤生长的需求。因此，血管内皮细胞的增殖和迁移速度会间接决定肿瘤的生长速度，同时新生血管也是肿瘤细胞转移至其他组织的重要途径。肿瘤血管新生的程度可作为肿瘤预后的重要指标[1-2]。抗血管生成也逐渐成为临床上肿瘤治疗的新途径[3]。

TWIST1在生物进化过程中高度保守，是影响胚胎发育和肿瘤生成的重要转录因子[4-5]。TWIST1可促进肿瘤细胞增殖，降低肿瘤细胞凋亡和药物敏感性[6-7]，此外，TWIST1与肿瘤的转移、侵袭和浸润能力也密切相关[6,8-10]，是诱导上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的关键调节因子，而EMT 是癌症转移起始的关键过程[11]。

研究表明，TWIST1高表达可以促进肿瘤血管的形成[11]。在乳腺癌和肝癌细胞中TWIST1 的高表达被证明是血管形成的关键因素[12-13]；肿瘤细胞中凝血酶促进内皮细胞迁移，基质小管和肿瘤血管的形成也与TWIST1 上调表达相关[14]；此外，TWIST1 还通过激活Jagged-1 诱导肿瘤细胞向内皮细胞分化，促进血管拟态（vasculogenic mimicry，VM）生成[15]。

近年来，有研究发现，TWIST1 与血管内皮细胞密切相关。在斑马鱼的胚胎脉管系统、猪的动脉内皮以及人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中均有 TWIST1 的表达[16]。有报道指出，TWIST1 可以通过调节内皮细胞中Tie2的转录控制小鼠肺血管的通透性[17]，还可通过改变血管内皮生长因子受体2（vascular growth factor receptor 2，VEGFR2）的表达控制新生小鼠的视网膜血管生成[18]。VEGF 和VEGFR 在早期胚胎血管发育以及后期新生血管形成中均具有关键作用[19]，且VEGF-VEGFR2 是调控血管通透性的重要信号通路。有研究发现vegfr2突变体小鼠肿瘤内的血管通透性明显降低，对化疗的敏感性增加，且肿瘤细胞的转移扩散也受到抑制[20]。

HUVECs 常被作为体外实验的细胞模型，用于研究内皮细胞生物学特性及其与各种疾病的关系。但目前TWIST1 对HUVECs 的功能是否具有调控作用，以及是否能影响VEGFR2 的表达尚不明确。本研究旨在探究TWIST1在HUVECs增殖、迁移和体外血管生成中的作用，以及其与VEGFR2表达间的关系，以期为进一步揭示TWIST1与肿瘤血管新生和迁移的关系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜脐带由天津中心妇产医院提供，293T 细胞系均由本实验室保存。pLL3.7-shTwist1-GFP和pLL3.7-shCtrl-GFP 质粒由本实验室构建、鉴定并保存[21]。

内皮细胞专用培养基购自美国Sciencell 公司；FBS、RPMI 1640 均购自美国 GIBCO 公司；MatrigelTMMatrix 购自美国 Corning 公司；RNA 小量提取试剂盒（RNeasy Mini Kit）购自Qiagen 公司；SYBR green PCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公司；AnnexinV/7AAD 细胞凋亡试剂盒购自美国BD 公司；LipofectamineTM2000、OPTI-MEM、反转录试剂盒购自Invitrogen公司。StepOnePlus/7500 Realtime PCR 仪购自美国 Applied Biosystems 公司；LSRII 流式细胞仪购自美国BD 公司；CO2细胞培养箱购自德国Thermo Fisher Scientific 公司；TE2000-S荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞提取与培养 无菌条件下，用预热PBS 彻底清洗脐带。0.25%的胰酶/EDTA 充盈整根脐带，37 ℃消化15 min 后收集细胞，用含血清的完全培养基轻轻吹打混匀，接种至25T 塑料培养瓶中，37 ℃5% CO2的孵箱培养24 h 后更换为内皮细胞专用培养基。换液间隔为2～3 d，观察待细胞融合后，以1∶3的比例消化传代，选取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 病毒的制备和感染 将载体质粒和包装质粒通过脂质体法共转染HEK293T 细胞，包装慢病毒。分别于48、72 h 后收集病毒上清并浓缩，于-80 ℃冰箱保存备用。内皮细胞完全培养基培养HUVECs，选用第 2～3 代，以每孔 2×105个接种于6 孔板，待细胞生长过夜，用有靶向人TWIST1基因shRNA（pLL3.7-shTwist1-GFP）的慢病毒液感染试验组细胞，同时以携带Scramble shRNA 的慢病毒（pLL3.7-shCtrl-GFP）感染对照组细胞，37 ℃5%CO2培养箱培养。感染72 h 后，用流式细胞仪检测GFP+细胞的比例即为感染效率（试验组和对照组细胞感染效率均为80%以上）。

1.2.3 qRT-PCR 检 测 TWIST1 及VEGFR2基 因 的表达 流式细胞仪分选pLL3.7-shTwist1-GFP 和pLL3.7-shCtrl-GFP 感染后的 GFP+细胞，用 RNA 提取试剂盒提取细胞mRNA，步骤按说明书进行。将RNA 反转录为cDNA，按照SYBR PCR Master Mix说明书配置10 μL的混合液体系进行qPCR反应。以 Actin 为内参，采用 2－ΔΔCt法计算TWIST1和VEGFR2的mRNA 相对表达量，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of primer in PCR

1.2.4 细胞计数法测定HUVECs 细胞增殖活性取处于对数生长期的HUVECs-shCtrl 和HUVECsshTwist1细胞，调整至合适浓度（1×104cells·mL-1），混合均匀后分别以500 μL·孔-1接种至24 孔板。37℃5% CO2培养箱培养。每隔24 h 两组各取3个复孔进行消化计数，取平均值，并绘制细胞生长曲线。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 将试验组和对照组细胞以合适浓度（2×105个·mL-1）接种于6孔板中，待细胞融合度超过80%时，用200 μL 吸头垂直细胞平面，作出一条平整均匀的划痕，使用无菌PBS 洗掉脱落的细胞，更换新鲜不含血清的培养基。将细胞置于37 ℃5% CO2培养箱中培养。培养24 h 后于显微镜下记录划痕的宽度，计算方式如公式（1）所示。

1.2.6 小管形成实验检测HUVECs 血管形成能力 提前在4 ℃冰箱将基质胶解冻过夜，并将所有塑料制品提前冷却。用无血清培养基将基质胶稀释后，以每孔250 μL 加入提前冷却好的24孔板中。37 ℃培养箱放置1 h，待基质胶固化后备用。将试验组、对照组细胞以每孔2×105个接种于基质胶表面。孵箱中培养24 h 后，用倒置显微镜（×100）拍照记录。每组细胞各取3 个视野，记录总小管分支长度和毛细血管样结构形成数。

1.2.7 Annexin V/7AAD 染色检测细胞凋亡 在病毒感染后，取试验组、对照组细胞各1×106个，离心后弃上清，用Annexin V-APC/7AAD 进行双染色，1 h内上机检测，比较两组细胞的凋亡比例。

1.2.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 软件进行绘图，SPSS 24.0 软件进行数据分析，实验数据以平均值±标准差（）表示，比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 shCtrl 和shTwist1 慢病毒载体感染HUVECs结果分析

经 293T 细胞包装后的 shCtrl 和 shTwist1 慢病毒载体感染72 h 后，倒置荧光显微镜检测表明，HUVECs-shCtrl 和 HUVECs-shTwist1 绝大 多 数细胞均带有GFP 标记的绿色荧光，表明pLL3.7-shC-trl-GFP和pLL3.7-shTwist1-GFP成功感染HUVECs细胞（图1）。对照组和试验组细胞中GFP+细胞占比分别为81%±2.8%和82%±1.4%，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 感染72 h后对照组和试验组HUVECs光镜和荧光显微镜下的观察结果Fig.1 The observation results of HUVECs in the control group and the experimental group under light microscope and fluorescence microscope after 72 hours infection

2.2 感染敲降载体pLL3.7-shTwist1-GFP对HUVECs中TWIST1 mRNA表达水平的影响

qRT-PCR 检测结果显示，试验组细胞TWIST1的表达水平是对照组的30%（图2），表明感染pLL3.7-shTwist1-GFP使HUVECs中TWIST1mRNA的表达水平显著下降（P＜0.01），提示试验组的TWIST1成功敲低。

图2 试验组和对照组HUVECs中TWIST1 mRNA水平比较Fig.2 Comparison of TWIST1 mRNA levels in HUVECs between experimental group and control group

2.3 TWIST1 表达对 HUVECs 细胞增殖、凋亡的影响

通过细胞计数法，绘制对照组和试验组的细胞生长曲线（图3A）。结果显示，与对照组相比，试验组生长速度明显减慢（P＜0.01）。Annexin V/7AAD 检测凋亡发现试验组细胞凋亡比例显著高于对照组（P＜0.05）（图3B），提示TWIST1 表达降低会抑制HUVECs细胞增殖，促进细胞凋亡。

图3 HUVECs生长曲线和凋亡率Fig.3 Growth curve and apoptosis rate of HUVECs

2.4 TWIST1 表达下降对HUVECs 细胞迁移的影响

HUVECs 细胞划痕实验表明，划痕后24 h，试验组细胞划痕愈合率明显低于对照组（P＜0.01）（图4），表明TWIST1 表达下降明显抑制了HUVECs细胞的迁移能力。

图4 HUVECs细胞划痕实验和划痕愈合率Fig.4 Scratch test and scratch healing rate of HUVECs cells

2.5 TWIST1 表达下降对HUVECs 血管样结构形成的影响

体外小管形成实验表明，与对照组相比，试验组HUVECs 在体外形成的血管样结构明显减少（P＜0.01），试验组总小管分支长度也显著短于对照组（P＜0.01）（图5），表明TWIST1基因沉默抑制HUVECs细胞增殖、促进细胞凋亡。

图5 HUVECS血管样结构、总小管分支长度和毛细血管样结构数Fig.5 Vascular-like structure of HUVECs,total tubular branch length and capillary like structure number

2.6 TWIST1敲降对HUVECs中VEGFR2 mRNA水平的影响

如图6所示，试验组VEGFR2mRNA水平显著低于对照组（P＜0.01），提示TWIST1基因下调抑制了HUVEC中VEGFR2的表达。

图6 试验组和对照组HUVECs中VEGFR2 mRNA水平比较Fig.6 Comparison of VEGFR2 mRNA levels in HUVECs between experimental group and control group

3 讨论

肿瘤的生长、转移及侵袭依赖于血管新生，在该过程中，肿瘤细胞可以诱导血管内皮细胞从静止状态转变为快速增殖状态，且多以发芽的方式生成新的毛细血管，并可以在短时间内建立血流供应。若失去血管新生的能力，大多数实体瘤将停止生长，进入休眠状态[22]。因此，探索调节肿瘤血管形成能力的新基因和机制，已成为抗肿瘤血管新生治疗领域的热点[23]。

在脊椎动物中，TWIST1 参与调节细胞发育、上皮间质转化和肿瘤转移，在各种上皮来源的恶性肿瘤[9,24-26]、肉瘤[27]、黑色素瘤[28]和神经胶质瘤[29]中均可检测到TWIST1 的表达，并且TWIST1 常与肿瘤的侵袭和转移呈正相关[30]。新生血管也是介导大多数肿瘤细胞转移和侵袭的重要途径。已有报道表明血管内皮细胞中TWIST1 呈高表达[16-17,31]，提示TWIST1 可能与肿瘤中的血管生成密切相关。

本研究采用慢病毒载体pLL3.7-shTwist1感染HUVECs 敲降 TWIST1 的表达，发现 TWIST1 表达下降能够抑制内皮细胞的增殖，促进细胞凋亡。Valsesia-wittmann 等[32]研究表明 TWIST1 过表达可使神经母细胞瘤参与凋亡反应的ARF/p53通路受到抑制。TWIST1 抑制血管内皮细胞凋亡的具体分子机制尚有待后续试验阐明。血管内皮细胞迁移是新生血管形成的基础。本研究中敲降TWIST1后，明显抑制了HUVECs 的迁移能力。E-钙粘素是一种重要的细胞粘附分子，与细胞迁移能力密切相关。有研究报道，TWIST1可以直接与E-钙粘素启动子结合，抑制E-钙粘素基因的表达[33]，显著增强肝癌细胞的运动能力和侵袭性[34]。在HUVECs中，TWIST1是否通过E-钙粘素促进内皮细胞迁移还需要进一步研究。VEGF和VEGFR在生理、病理条件下的血管生成中发挥重要作用[35]。其中，VEGFR2 是导致肿瘤血管生成最重要的通路之一，目前临床上有多种靶向VEGFVEGFR2 通路的抗体，已广泛用于癌症治疗[36]。有报道指出VEGFR2 的启动子区存在能结合TWIST1 的 E-box 结构域[31]。本研究发现，VEGFR2mRNA 水平随着TWIST1 的表达下降而显著降低，表明TWIST1可能通过调控VEGFR2的表达影响血管生成。同时，通过检测TWIST1 与多种肿瘤血管内皮细胞特征的关系，均证实TWIST1具有促进作用，提示其可能参与肿瘤血管新生和转移行为。但本研究采用的模式细胞体外模型仍存在一定的局限性，TWIST1如何影响各类肿瘤内皮细胞功能，未来还需进一步体内试验证实。

综上所述，TWIST1在血管内皮细胞功能中发挥重要作用，本研究为进一步研究其在肿瘤血管新生中的作用奠定了理论基础，也为肿瘤的抗血管生成治疗提供了新的思路。